/html/blotting/western/index.html 杂交实验 / western杂交 zh-cn <a href='http://www.5ibio.com' target='_blank'>Power by DedeCms</a> jurgenyan##yahoo.com.cn /html/blotting/western/20080618/17685.html SDS、甘油、Tris、溴酚蓝、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED，APS、甘氨酸、甲醇、PVDF膜、Brandford蛋白定量试剂盒、BSA、脱脂奶粉、考麻斯亮蓝、丽春红、氯化钠、氯化钾、DTT、ECL、显影液、定影液等、显影胶片 2008-06-18 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070808/12226.html 如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Lammli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法,这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多,而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题,而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已 2007-08-08 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070808/12225.html Westernbloting技术是用来检测蛋白表达的特定的灵敏的方法，由蛋白质的SDS-PAGE、电转及杂交几部分组成。杂交技术主要有NC膜封闭，靶蛋白与第一抗体的反应，结合靶蛋白的一抗和二抗的反应，显色等组成。将凝胶上的蛋白质转移到NC膜上，用其他蛋白作为封闭液，将膜上余下 2007-08-08 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2705.html BlottingwithBSA Blotin5%mile/1XPBST(or1XTBST)--60'/Rt Wash2Xfor5'in1XPBST 10Abin1%BSA/1XPBST--60'/Rt WashPBST15',then3xfor5'eachin1XPBST 20Abin1%BSA/1XPBST--60'/Rt(aHRP)-- Wash15'with1XPBSTthen3xwith 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2704.html CARBONATEWESTERNTRANSFERSOLUTIONS Dunn,Anal.Biochem.1986:157 1.5L 1.0L 10mMNaHCO 3 1.26g chillto4 o C 0.84g 3mMNa 2 CO 3 0.477g pH~9.9 0.318g in20%MeOH 300mL 200mL Blot:noneedtopresoakgell. Transblot: 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2703.html 1.Loadgelinapparatusasdescribedbymanufacturer. 2.TransferproteinsaccordingtoaboveensuringthattheNCMistowardthepositiveelectrode.WhenusingtheHoeferapparatusbesuretoeitherprecoolthebufferandruntheuniti 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2702.html InaWesternblot,proteinsthatareseparatedonpolyacrylamidegelsonthebasisofsizearetransferredtoamembranefordetectionwithantibodies. PreparationofHumanCellExtracts (perYasuItoh,5/91) Add2volumesofautoclave 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2701.html WashXCellbox,blottingmoduleandtrayswithsoapandwaterbeforeproceeding. Reagents: Transferbuffer 25mMTrisHCl, 190mMGlycine 10%Methanol Blockingbuffer 5%non-fatdrymilkinTBS-TWEEN20 or 3%BSAinTBS. TBS-TWE 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2700.html WesternBlotProbingbyECL 1.Afterelectroblottingofproteingeltoimmobilonmembrane(See NovexNuPAGEmethod ),markthesideofthemembranenotincontactwiththegelwithpermanentinkandcutasmallcornerpieceoffthebottom 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2699.html Buffers: TBS : 25mlof1MTris-7.5,30mlof5MNaCl,bringvolumeupto1000mlwithddwater TBS-T : TBS+0.5mlofTween20 5XSDS-PAGErunningbuffer : 15.1gTrisbase,94gglycinein900mlwater,thenadd50mlof10%solutionofSDS,a 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2698.html Chen-MingFanLab,CarnegieInstituteofWashington (Allstepswithagitation,unlessdoneO/Nat4oC) RinsemembraneonceinTBS-T BlockthemembranewithTBS-T/5%milk(orHIHS)for30minroom temp(canbeleftat4oCO/Nhere) Rins 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2697.html 1)Rungel(in1:10running/transferbuffer(10x)andH2Oforatotalof1litre)at150voltsuntilleadingbromophenolbluebandisnearingthebottomedgeoftheglassplatesoraccordingtotheexpectedmigrationoftheproteinofinteres 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2696.html BeginwesternblotprocedurebyloadingproteinintoSDS–polyacrylamidegel.Onthewhole,Inormallyuse8,10,or12%gels(dependingonthesizeofproteinyouruninthegel). Rungelataround120volts.Inormallystopthegelrunningp 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2695.html Treatcells.ForPC12orNIH3T3cellsamoderatelyconfluent60mmplateisused. Aspiratemedia.RinsecellswithPBS,aspirate. Lysecellsin200uLofSDSsamplebuffer(100oC).Immediatelyscrapethecellsofftheplatewitharubberp 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070115/2694.html Culturebacteria 1.GrowglycerolstockA13(TBP-GSTinBL21)in10mLLBand10ulampicillin(1:1000) 2.Shake@37CON Inducebacteria 3.AdjustculturewithLBuntilONcultureOD[@600nm]is~0.6-0.8 4.Inducewith40mMIPTG(madefr 2007-01-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070114/2693.html ECL is an appealing technique because it is quick and very sensitive and does not expose the investigator to radioactivity 2007-01-14 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070114/2692.html Following electrophoresis, equilibrate the gels in transfer buffer. Equilibration facilitates the removal of electrophoresis buffer salts and detergents 2007-01-14 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070114/2691.html ECL Western blotting kit (Amersham Life Science; cat# RPN2108): contains second antibodies for both mouse and rabbit, substrate and milk blocker 2007-01-14 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20070114/2661.html METHOD for Western Blots 2007-01-14 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061226/2346.html 其实Wb没有理想的结果原因很多，比如说本身实验设计不合理，上游载体构建方面的问题，蛋白表达假阳性，蛋白抗原被封闭或是Wb本身操作不规范等等许多问题 2006-12-26 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/20061220/2178.html 该系统是在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中研究蛋白质间相互作用的一种非常有效的分子生物学方法。近几年来随着人们对该系统的广泛应用，这一系统得到了不断的完善及改进 2006-12-20 杂交实验 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1888.html 表1 Commonproblemsforelectrophoresisandwesternbloting 问题 可能原因 建议解决方法 推荐电压条件下电泳时间过长。 电泳缓冲液过希 配制新鲜缓冲液，使用1X稀释液。 推荐电压条件下电流过高，热量过大。 电泳缓冲 2006-10-31 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1887.html 下面的步骤适用于通过XcellⅡ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果，用户的优化是必要的。 I.所需材料： XcellSureLock或XcellⅡMini-Cell以及BlotModule（Cat.Nos.EI10001,EI9001及EI9051） 电泳后的 2006-10-31 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1847.html 下面的步骤适用于通过Xcell Ⅱ转印系统进行蛋白印记的大部分应用。为达到最佳效果，用户的优化是必要的。a) 转膜缓冲液- 请注意对大多数转膜我们推荐使用强度减半的Towbin缓冲液，其中含有20％的甲醇。使用Xcell Ⅱ转印 2006-11-12 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1846.html 电泳和Western转印的常见问题：推荐电压条件下电泳时间过长；推荐电压条件下电流过低或无电流。条带模糊；蛋白带型条状；哑铃形条带或“微笑”条带。 2006-11-12 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1845.html Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作 为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 一、原理 与Southern或Northern杂 2006-10-15 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1843.html CellLysatesForWesternBlotting Reagents/Solutions LysisBuffer: 10ml10%Sodiumdodecylsulphate(SDS) 10mlGlycerol 10mlb-mercaptoethanol 8ml0.5MTrispH6.8 1ml0.1%bromophenolblue 51mlH 2 O Protocol Spindown1 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1844.html WesternBlotMaterials Semi-dry TransferApparatus Biorad,Cat#170-3940,orequivalent PowerSupply 0-100VDC(adj.currentto1Amp) Immobilon-P transfermembrane 0.45mporesize;cuttosamesizeasgel(Millipore,Cat#IP 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1842.html Materials BlotCell BA830.2mporenitrocellulosesheets Buffer,PBS-Tween20 Antigenicproteins,antibodies,andhorseradishperoxidaselabeledantiglobulins Procedure 21 Runanelectrophoreticseparationofknownanti 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1841.html WesternBlot 1) Runproteingel. Setupblot: 2) Preparetwotupperwarecontainers,onewithdH 2 Oandonewith1/2XTransferBuffer(TB). 3) Removeoneglassplatefromthegelbytwistingaspacerbetweentheplates.Toremovethe 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1839.html RunningProteinGels Solutions 10XRunningBuffer(0.25MTris,1.92Mglycine,1%SDS) 121gTris 577gglycine 40gSDS ddh20to4L(checkpHat1:10dilution(pH=~8.8)). 5XSampleBuffer(0.3125MTrispH6.8,10%SDS,50%glycerol,0 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1840.html REAGENTS ECLWesternblottingkit(AmershamLifeScience;cat#RPN2108):containssecondantibodiesforbothmouseandrabbit,substrateandmilkblocker(themilkblockerisnotnormallyusedwhenusingruminantsamples). HybondE 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1838.html StudyingProteinInteractionsbyFar-WesternBlotting Far-Westernblottingwasoriginallydevelopedtoscreenproteinexpressionlibrarieswith 32 P-labeledglutathioneS-transferase(GST)-fusionprotein.Far-Westernblo 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1837.html 1.Runsamplesoutonagel.Forbacteriallyexpressedproteins,generally5uLisplenty(1mlcellculture;cellsresuspededin50ulloadingbuffer).Runthegels(BioRadminigels)at195Vforapproximately40min.(untilsamplesrunclo 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1835.html 点击浏览该文件 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1836.html PutthemembraneinPBSorTBSwith7ul/mlB-mercaptoetanoland2%SDSfor30'atRTinagitation Washthemembranefor30'inPBSorTBS. Putthemembraneinblockingbuffer 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1832.html TroubleshootingGuide:WesternBlot Problem:PoorTransfer PossibleSource TestorAction Membranedoesnotwetuniformly Pre-wetmembranein100%methanol MWofproteinislessthan10,000 IfproteinhasMW10,000,itmayhave 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1833.html 1.PerformSDS-polyacrylamidegelelectrophoresis(SDS-PAGE)onacellsamplepreparedusingmodified RIPAbuffer andtransfertheproteinstoanitrocellulosemembrane. 2.WashthenitrocellulosetwicewithdistilledH 2 O.St 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网 /html/blotting/western/20061112/1834.html ToomanybandsonaWesternblot Western-orimmunoblottingisacommonlyemployedtechniqueforthedetectionofproteinantigensincomplexmixtures.SamplesarefirstseparatedbySDS-polyacrylamidegelelectrophoresis.Thesepa 2006-09-27 western杂交 秩名 生物实验网