[3]在pET32a载体中插入片段
连接反应
2ul   10×连接buffer
2-5ul   50ng/ul 预制的pET32a载体
1ul   T4连接酶
5-7ul   预制目标基因插入片段
加水到20ul，枪头混匀，16℃反应2h－过夜
[4]转化
转化方法同T－载体转化大肠杆菌DH5α一样，既可转化BL21也可转化DH5α，若转化DH5α，需要重新抽提质粒，再转化BL21。筛选LB平板需含50ug/ul 卡那霉素。
[5]pET重组子鉴定
如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。
[6]DE3溶原菌的诱导表达
（1）、从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50ug/ul 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。
（2）、培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac启动子），继续培养2-3小时。
（3）、将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。
（4）、重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl （pH8.0）中，离心。
（5）、除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。
[7]SDS-PAGE进行目标蛋白质分析
（1）、机械破碎细胞。一般用弗氏压碎法或超声波处理。
（2）、裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。
（3）100ul可溶上清中加入100ul 4×SDS上样buffer和水。85℃迅速加热3min使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。
（4）若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。750ul20mMTris-HCl, pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min, 除去上清重复洗涤。然后1.5ml 1％SDS上样buffer中重悬沉淀，重复（3）的步骤进行SDS-PAGE分析。

3.总结（注意事项）
(1)   所有操作尽量在冰上操作，以避免蛋白质发生变性；
(2)   根据自己的需要选择不同的表达载体，并注意不同的表达载体上的融合标签和携带的抗性基因，其中有些标签是可以去除的。具体的序列和说明都可以从www.novagen.com中下载。
(3)   构建好的载体最好进行测序验证，保证读码框正确，即没有移码。
(4)   长期保存的pET重组子在高浓度甘油（19％）中会导致质粒不稳定。
(5)   T7lac启动子是严谨启动子，IPTG诱导时可以优化最佳浓度（25uM-1mM之间）使目的蛋白达到最佳的活性和溶解性。
(6)   37℃生长常常会使一些蛋白累积形成包涵体，而30℃生长则可能产生可溶的和有活性的蛋白。在某些情况下，低温（15－20℃）延长诱导时间（过夜）可以使溶解性蛋白的产量达到最大。
(7)   进行SDS-PAGE分析时，需优化电泳上样体积。