已经建立了多种策略以帮助蛋白质天然空间结构的形成[131]。这些策略包括在较低温度下培养细菌[132]，选择不同的E.coli菌株[133]，替换某些氨基酸残基[134]，与分子伴侣共表达[135,136,137]，利用高溶解性的多肽作为共表达分子[138]，在山梨糖醇和甘氨酸三甲内盐存在时，以低渗透压培养和诱导细胞[139]，改变培养基的pH值[140]。与分子伴侣共表达或许是一种有望提高蛋白质可溶性和折叠效率的途径[141]。但这种策略似乎具有蛋白质特异性[142]。即便在分子伴侣存在的条件下，仍有多种因素使得过量表达的蛋白不能折叠成其天然构象。这些因素包括缺乏二硫键和/或翻译后修饰；细胞质的氧化还原状态妨碍了二硫键的形成。在E.coli中，有两条途径参与二硫键的还原。即硫氧还蛋白系统，该系统由硫氧还蛋白还原酶和硫氧还蛋白组成；谷氧还蛋白系统，该系统由谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽和三种谷氧还蛋白组成[143]。制造次还原细胞质环境，以利于二硫键形成的策略包括选用硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷的E.coli菌株,这有助于巯基还原势能。
蛋白质在细胞质中被降解的可能性比其他细胞室要大得多。因为在细胞质中含有大量的蛋白酶。另外，从细胞质蛋白混合物中纯化目的蛋白相对比较困难，因为在此细胞室包含总细胞蛋白的绝大部分蛋白[144]。
2．细胞外周质表达
在细胞外周质进行蛋白质表达有许多优越之处。在外周质只有4%的总细胞蛋白，这显然有利于目的蛋白的纯化，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在转移到外周质的过程中，信号肽在细胞内剪切更有可能产生目的蛋白的天然N-末端。此外，外周质中的蛋白质降解也少得多[145]。蛋白质通过内膜转运到外周质需要信号肽[146，147，148]。许多原核和真核细胞来源的信号肽已成功地用于Ecoli中蛋白质从内膜到外周质的转运。如E.coli的PhoA信号[149]、OmpA[150]、OmpT[151]、LamB和OmpF[152]以及金黄色葡萄球菌的A蛋白[153]，鼠RNase[154]和人生长激素信号肽[155]等。但是，蛋白质转运到细菌外周质是一个特别复杂和尚未完全明了的过程，信号肽的存在并不总能保证有效的蛋白质通过内膜转运[156]。改善蛋白质转运到外周质的策略包括提供蛋白质转运和加工所需的成分：过量表达信号肽酶I[157]，利用prlF突变株[158]，共表达参与膜转运的几种蛋白质，降低蛋白质的表达水平以防止转运工具的过载[159]。
3．  细胞外分泌（外泌）
 将蛋白质分泌到细胞外是人们最期望的一种策略。因为这样容易纯化目的蛋白质，减少细菌的蛋白酶对目的蛋白质的裂解。但是，E.coli在正常情况下只有很少量的蛋白质分泌到细胞外。要解决蛋白质外泌方面的难题，必须弄清E.coli的分泌途径。Pugsley[160]对革兰氏阴性菌的分泌途径进行了详细的研究。在E.coli中将蛋白质分泌到培养基中的方法大致分为两类：（1）利用已有的“真正”的分泌蛋白所采用的途径[161]；（2）利用信号肽序列、融合伴侣和具有穿透能力的因子。第一种方法具有将目的蛋白质特异性分泌的优点，并最小限度地减少了非目的蛋白的污染。最突出的例子是溶血素基因，该基因曾被用于构建分泌的杂交蛋白[162，163]；第二种方法依赖于有限渗透的诱导而导致蛋白质的分泌。例如应用pelB[164]、ompA[165]和A蛋白引导序列[153，166]；与细菌素释放蛋白的共表达[167]；丝裂霉素诱导的细菌素释放蛋白和在培养基中添加甘氨酸[168]以及与kil基因共表达而进行膜穿透[169]。但通常情况下，外泌蛋白质的产量是中等的。有文献报道[170]，在大肠杆菌表达系统中，金黄色葡萄球菌A蛋白的信号肽能引导带有E结构域的A蛋白片段或融合产物从细胞质外泌到培养基中，蛋白的外泌表达发生于细胞生长后期。但所用的启动子为A蛋白自身的启动子，该启动子在大肠杆菌中为非可控性的组成性表达，且强度较弱。如果能利用可控的强启动子进行A蛋白信号肽引导的基因表达，则有望在蛋白质外泌方面有所突破。目前我们正在进行这方面的尝试，且已经取得初步成效。 
  
 密码子的使用
   原核和真核生物的基因对同义密码子的使用均表现非随机性[171，172]。对E.coli中密码子的使用频率进行系统分析得到以下结论[173]：（1）对于绝大多数的简并密码子中的一个或两个具有偏好；（2）某些密码子对所有不同的基因都是最常用的，无论蛋白质的含量多少，例如CCG是脯氨酸最常用的密码子；（3）高度表达的基因比低表达的基因表现更大程度的密码子偏好；（4）同义密码子的使用频率与相应的tRNA含量有高度相关性。这些结果暗示,富含E.coli不常用密码子（表1）的外源基因有可能在E.coli中得不到有效表达。已经证明[174]，微精氨酸tRNAArg(AGG/AGA)是多种哺乳动物基因在细菌中表达的限制因子。因为AGA和AGG在E.coli中不常用。如果共表达编码tRNAArg(AGG/AGA)的argU(dnaY)基因，就会高水平表达目的蛋白[174]。但利用同方法所进行的另外几项研究的结果却不一致[175，176]。其他的研究表明,通过用常用密码子替换稀有密码子或与“稀有”tRNA基因共表达可以提高外源基因在E.coli中的表达水平[177，178]。许多研究者对有关密码子使用模式的进化意义和密码子使用效果的机制进行了研究，但至今尚未找到协调密码子的使用和转录本翻译的精确规则。似乎在转录本5’末端附近存在稀有密码子将会影响翻译效率。另外，基因5’编码区中GC含量似乎也影响其表达。这在人胸苷酸激酶（TS）中已经得到证明[179]。在不改变所编码蛋白的前提下，将TS cDNA的第三、四、五密码子的嘌呤碱基变成胸腺嘧啶，使得TS基因的表达占到E.coli中总蛋白量的25-30%。综上所述，有许多可变因素可能影响实验结果，如位置效应、稀有密码子的群集和mRNA的二级结构等等。