上述这些发现充分证明，除了SD位点和起始密码子以外，mRNA中的其他序列对于有效的翻译也是重要的。尽管其精确的机制还不太清楚，但有可能利用翻译增强子来达到超量表达蛋白质的目的。
3．mRNA的稳定性
     mRNA的快速降解势必影响蛋白质的产生。因此在这一部分重点阐述决定mRNA稳定性的因素，这将在E.coli高效表达外源基因中有实际应用。在E.coli中有多种不同的RNase参与mRNA的降解，其中包括内切核酸酶（RNase E, RNase K和RNase III）和3’外切核酸酶（RNase II和多聚核苷酸磷酸化酶[PNPase]），目前尚未在原核细胞中发现5’外切核酸酶[110]。mRNA的降解并非由非特异性的外切核酸酶随机剪切而引起，因为在mRNA的长度和半衰期之间并没有反向相关性[111]。已经证明，在E.coli中有两类保护性元件能够稳定mRNA。一类由mRNA的5’UTRs中的序列组成[112]；另一类由3’UTRs和多顺反子间区的发卡结构组成[113]。其中一些元件与异源mRNA融合后起稳定剂作用，但只在严格的条件下如此。例如，噬菌体T4基因32的5’UTR在T4噬菌体感染的细胞中延长非稳定mRNA在E.coli中的半衰期[114]。革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的红霉素抗性基因（erm）编码的mRNA 5’UTR含有稳定元件。但ermC和ermA 5’UTRs的稳定作用需要由抑制翻译和引起核糖体失控的抗生素来诱导[115]。同样，噬菌体λPL对于λPL-trp转录本的稳定作用需要λ噬菌体的感染[116]。与此相反，E.coli ompA转录本能够在细胞快速增殖的正常情况下延长一系列异源mRNA在E.coli中的稳定性[117]。Emory等证明，在接近或紧接ompA 5’UTR的5’末端存在发卡结构对于其稳定效果是必需的。而且可以通过在5’末端添加发卡结构来延长在正常情况下不稳定的mRNA的半衰期[118]。这样看来，对异源基因添加ompA 5’稳定元有可能提高E.coli中的基因表达。另一类由3’UTR组成的mRNA保护性元件能够形成发卡结构，因而能够阻断外切核酸酶从3’末端对转录本的降解[113]。Wong和Chang[119]在苏云金杆菌的晶体蛋白基因的转录终止子中鉴定了一个这样的元件。将该“阳性反调节子”与地衣杆菌的青霉素酶基因(penP)的3’末端和人IL-2 cDNA融合，能够延长mRNA的半衰期，且提高了相应多肽在枯草杆菌和E.coli中的产量。然而，同某些5’稳定元一样，这类3’反向调节子不可能作为一个通用的mRNA稳定元。而且有证据表明，可以通过选用缺乏某些特定RNase如RNaseII或PNPase的宿主菌来提高基因的表达。这同样并非一有效途径。因为缺乏RNaseII或PNPase与RNase过量表达一样，对于E.coli整体mRNA的平均半衰期并无多大影响。而且缺乏RNaseII或PNPase的菌株常常是不稳定的[120,121]。
    4．翻译终止
 在mRNA中存在终止信号是翻译终止过程必不可少的。除了三个终止密码子UAA、UGA、
和UAG外，翻译终止这一复杂事件还包括核糖体、mRNA和终止位点的几种释放因子的特异相互作用[122]。在E.coli中，RF-1在终止密码子UGA处终止翻译；RF-2在UAA密码子处终止翻译[123]。最近还克隆了另外一个因子RF-3[124]。
在设计表达载体时，通常插入三个终止密码子以防止核糖体的跳跃。在E.coli中偏向于使用UAA密码子[125]。一项对于2000多个E.coli基因的统计分析表明，在终止密码子和紧接三联体的核苷酸序列中存在局部非随机性[126]。同时他们还利用体内终止试验测定12个可能的四核苷酸“终止信号”（UAAN、UGAN、UAGN）的终止力量。在体内终止试验中，通过其与框架移位的竞争测定其终止效率。转录效率依据终止密码子和第四个核苷酸而有显著的差异，这种差异从80%（UAAU）到7%（UGAC）不等。这些研究表明，紧接终止密码子后的核苷酸特性强烈地影响E.coli中的翻译终止效率[127]。UAAU是E.coli中最有效的转录终止序列。此外，终止密码子5’末端的邻近序列也影响终止的效率。因此，新生肽中倒数第二位（-2位）C-末端氨基酸残基的电荷和疏水性能引起多达30倍不同的UGA终止效率，而在UAG位的终止对于-2位氨基酸残基的特性不敏感[128]。对于-1位，α-螺旋、β-链和回转倾向是UGA终止中的决定因素[129]。
 
蛋白质靶向
   确定将目的蛋白表达在特定的细胞室，即细胞质、细胞间质或是培养基中，需要权衡各自的利弊。
1．细胞质表达
包涵体的形成仍然是在细胞质中进行基因表达的一个主要障碍。包涵体虽然具有多方面的好处，但这些优越之处与后期繁琐的蛋白重新折叠工作、重叠蛋白的生物活性的未知性以及重叠和纯化后蛋白的总产量降低相比，则显得微不足道。至今尚不明了包涵体形成的精确机制。对于形成和不形成包涵体的81种蛋白质的统计学分析表明，有6个主要的理化指标与此有关。这6个指标是电荷平均数、转变形成的残基组分、半胱氨酸组分、脯氨酸组分、亲水性和残基总数。其中前两个指标与包涵体形成密切相关。一种基于这些指标的模型可以根据某种蛋白质的氨基酸组成来预测包涵体形成的可能性。该模型曾成功地预测人T细胞受体Vβ5.3在E.coli中的可溶性[130] 。