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| [ 文章来源： | 文章作者：
| 发布时间：2007-05-28|
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原理
GST纯化系统是利用GST（glutathione-S-transferase ） 融合蛋白与固定的谷胱甘肽（GSH）
通过硫键共价亲和，通过GSH交换洗脱的原理来进行纯化。1ml树脂大约可结合5-8 mg融合蛋白，并可反复使用数次。
试剂
u IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）
2g IPTG 溶解入10ml 水，过滤除菌，分装，-20℃保存。
u Lysis buffer （50ml）
1) 2.5ml 1 M Tris，pH8.0
2) 0.1ml 0.5ml EDTA
3) 0.292g NaCl
4) 0.5ml Triton X-100
5) 0.25ml 1M DTT
u Elution buffer
1) 0.615g glutathione
2) 10 ml 1M Tris，pH8.0
3) 90ml distilled water
操作步骤
1) 挑一个克隆至2ml LB液中（Amp+）
2) 37℃振摇至OD600值约为0.6
3) 将2ml菌液加入100 ml LB中
4) 37℃振摇至OD600值约为0.6
5) 加入IPTG至终浓度为1mM
6) 继续摇3～4h
7) 离心（5000 rpm，5min，4℃）
8) 用10×柱体积的lysis buffer悬浮细菌
9) 超声破碎细胞
10) 离心（12,000rpm, 15min, 4℃），取上清
11) 用滤纸过滤
12) 加0.5 ml 50%谷胱甘肽琼脂糖beads于层析柱
13) 5×柱体积的lysis buffer洗层析柱
14) 样品过柱
15) 5×柱体积的lysis buffer洗层析柱
16) 3×柱体积的elution buffer洗脱蛋白
17) 收集蛋白：0.5ml/管
18) 取20ml样品SDS-PAGE鉴定
可以在buffer里增加点 蛋白酶抑制剂，防止 蛋白的降解。 |
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