Western Blot 实验试剂选购指南
(一)蛋白质电泳
1.请参照常规电泳操作.
2.分子量标准:
可选择普通分子量标准或预染的分子量标准.在选择预染的分子量标准时,要注意其优点和缺点:
优点: 在电泳过程中可监控蛋白质分离状态; 可指示转印中蛋白质的转印效率.
缺点: 染料影响蛋白质移动速度;分子量测定略欠精确;影响蛋白质与膜的结合力.
购买信息:
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中范围蛋白质分子量标准(14.3-97.4KD) |
V5235S |
200μg |
国产 |
80元 |
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分子量大小:（14.3、21.5、31、40、42.7、55、66.2、97.4KD） |
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中范围蛋白质分子量标准(24-97KD) |
MTB087-1 |
20次 |
国产 |
80元 |
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分子量大小:（24、36、53、66、97KD） |
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低范围蛋白质分子量标准（6.5-66KD） |
M3913-1 |
20次 |
Sigma |
280元 |
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低范围蛋白质分子量标准（6.5-66KD） |
M3913-1 |
5×20次 |
Sigma |
1198元 |
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分子量大小:（6.5、20、24、29、36、45、66KD） |
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高范围蛋白质分子量标准（36-205KD) |
M3788-1 |
20次 |
Sigma |
280元 |
|
高范围蛋白质分子量标准（36-205KD) |
M3788-1 |
5×20次 |
Sigma |
1198元 |
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分子量大小:（36、45、55、66、84、97、116、205KD） |
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宽范围蛋白质分子量标准（6.5-205KD) |
M4038-1 |
20次 |
Sigma |
280元 |
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宽范围蛋白质分子量标准（6.5-205KD) |
M4038-1 |
5×20次 |
Sigma |
1266元 |
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分子量大小:（6.5、14.2、20、24、29、36、45、55、66KD） |
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预染的低范围蛋白质分子量标准(18-80KD) |
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20次 |
自产 |
320元 |
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预染的低范围蛋白质分子量标准(18-80KD) |
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50次 |
自产 |
680元 |
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分子量大小: 80, 60, 39, 23, 18 kDa |
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预染的中高范围蛋白质分子量标准(20-210KD) |
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20次 |
自产 |
320元 |
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预染的中高范围蛋白质分子量标准(20-210KD) |
|
50次 |
自产 |
680元 |
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分子量大小:210, 140, 106/102, 80, 52, 20 kDa |
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预染的中高范围蛋白质分子量标准(18.3-210KD) |
26681 |
48次 |
Pierce |
1214元 |
(二)蛋白质转印
a) 膜的选择:主要采用 NC膜和PVDF膜,其比较如下:
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NC膜 |
PVDF膜 |
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物理强度 |
差 |
好 |
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蛋白质结合能力 |
80-100ug/cm2 |
100-200ug/cm2 |
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溶剂耐受力 |
无 |
有 |
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考马斯亮兰染色 |
否 |
可以 |
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ECL检测 |
稍差 |
可以 |
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快速免疫检测 |
否 |
可以 |
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SDS存在下蛋白质结合 |
差 |
好 |
|
质谱分析 |
否 |
可以 |
(尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交)
b) 膜的大小: 请根据胶的面积来确定.
c) 膜的孔径: 0.45um适用一般蛋白质. 0.2um适用小分子蛋白质.
购买信息:
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66485 |
硝酸纤维素膜,0.45um,30cmX3m/卷 |
美国Gelman |
1395元/卷 |
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硝酸纤维素膜,0.45um,20cmX20cm |
美国Gelman |
80元/张 |
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硝酸纤维素膜,0.45um,20cmX20cm |
国产 |
30元/张 |
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60207 |
尼龙膜, 0.45um,30cmX3m/卷 |
美国Gelman |
2310元/卷 |
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尼龙膜, 0.45um,20cmX15cm |
美国Gelman |
90元/张 |
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尼龙膜, 0.45um,直径100mm,50张/盒 |
国产 |
260元/盒 |
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66543 |
PVDF膜, 0.45um,30cmX3m/卷 |
美国Gelman |
1690元/卷 |
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PVDF膜, 0.45um, 直径100mm,50张/盒 |
国产 |
260元/盒 |
(三) 蛋白质的显示(大部分实验不需要进行此步操作)
蛋白质染色的染料有很多种,各种的特点均不一样.
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蛋白质灵敏度 |
影响免疫检测 |
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Ponceau-S Red丽春红 |
5ug |
无 |
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快绿Fc |
5ug |
无 |
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Sypro Rose |
1-2ng |
无 |
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氨基黑10B |
1ug |
有 |
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考马斯亮兰R-250 |
500ng |
有 |
|
印度墨 |
100ng |
有 |
|
胶体金 |
4ng |
有 |
购买信息:
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Ponceau-S Red丽春红 |
Sigma原装 |
10g |
182元 |
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快绿Fc |
Amresco分装 |
25g |
258元 |
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氨基黑10B |
Sigma分装 |
10g |
168元 |
|
考马斯亮兰R-250 |
Amresco分装 |
10g |
168元 |
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蛋白银染试剂盒 |
自产MTB083-1 |
10次 |
188元 |
|
SDS-PAGE蛋白快速染色试剂 |
自产 |
25次 |
100元 |
|
Western Blot 膜可逆染色剂 |
自产 |
100ml |
100元 |
(四)免疫检测
有各种不同的免疫检测方法.请注意选择.方法不同,则所需的试剂也不同.如需方便,可选择完整的试剂盒.
A.封闭膜:
这一步会影响结果的成败和背景的强度.常用封闭剂为BSA和Tween20. 脱脂干奶粉不适合用于糖蛋白和生物素标记抗体.
购买信息:
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牛血清白蛋白组份五BSA |
Amresco分装 |
25g |
280元 |
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Tween 20 |
Amresco分装 |
500ml |
150元 |
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Western Blot 膜封闭剂 |
自产 |
100ml |
100元 |
B.一抗: 根据目的蛋白质选择.单抗或多抗均可.注意已变性蛋白质无法检测,必须采用非变性胶电泳. 我司有 R&D, Genex, Santa Cruz等公司的原装抗体或进口分装抗体.具体请参见免疫学部分产品----第一抗体.
C.标记二抗: 根据一抗的来源选择二抗.
购买信息: 请参见免疫学部分试剂---各种标记抗体
D.底物系统: 采用常规底物或化学发光底物.
(1) 显色法: 常用底物为BCIP/NBT或DAB .此法简单,但灵敏度不高,并难以从膜上去除.
(2) 化学发光法: 目前比较常用的方法.灵敏度较高,检测时可采用X光胶片或CCD成像系统.
不同显色方法产品比较如下:
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厂家 |
灵敏度 |
方法 |
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SuperSignalâ West Pico 化学发光底物 |
美国Pierce |
皮克级 |
化学发光法 |
|
SuperSignalâ West Dura 持久性化学发光底物 |
美国Pierce |
低飞克级 |
化学发光法 |
|
SuperSignalâ West Femto 高灵敏度化学发光底物 |
美国Pierce |
飞克级 |
化学发光法 |
|
ECL Kit |
Amersham |
飞克级 |
化学发光法 |
|
BCIP/NBT (AP酶) |
|
100pg |
显色法 |
|
DAB (HRP酶) |
|
100pg |
显色法 |
推荐产品:
SuperECL Plus Western Blotting 超敏发光液
采用独特的发光底物系统，是世界上最灵敏的ECL Western Blot 化学发光试剂。用于Western Blotting 条带的荧光发光，检测直接或间接标记辣根过氧化物酶HRP 的抗体及其关联的抗原。由两种溶液组成，使用前混合。SuperECL Plus 超敏发光液，价格低廉，灵敏度大大高出Amersham 和Santa Cruz 公司同类ECL 产品100 倍以上，也明显高出Pierce 的SuperSignal West Pico 化学发光系统数倍，但背景更干净，发光时间持久，可以长达10 小时以上。
特别适用于丰度极低而一般ECL 系统难于检测的目的蛋白。
特点如下：
ж 灵敏度极高，可检测10-100 fg 抗原。
ж 高信噪比，背境干净。
ж 发光迅速。
ж 发光持续12小时以上。
ж 可在日光灯下进行发光操作。
ж 节省抗体(一抗1:2000－1:6000；二抗1:4000－1:10000)。
ж 储存条件：4℃避光储存一年，偶尔室温放置数周不影响质量。
购买信息
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产品名称 |
规格 |
编号 |
价格 |
|
SuperECL Plus Western Blotting 超敏发光液 |
10ml |
P1010-10 |
138 |
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25ml |
P1010-25 |
266 |
|
100ml |
P1010-100 |
880 |
美国Pierce公司化 学 发 光 底 物 系 列
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SuperSignalâ 底物家族提供一系列的底物，适合免疫印迹的多种灵敏度要求。 |
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|
SuperSignalâ West Pico化学发光底物 |
SuperSignalâ West Dura 持久性化学发光底物 |
SuperSignalâ West Femto Maximum Sensitivity Substrate |
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更低检测极限(克) |
10-12 |
10-14 |
10-15 |
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建议抗体稀释度 |
一抗：1/1,000-1/5,000 |
一抗：1/1,000-1/50,000 |
一抗：1/5,000-1/100,000 |
|
二抗：1/20,000-1/100,000 |
二抗：1/20,000-1/250,000 |
二抗：1/100,000-1/500,000 |
|
信号持续时间 |
6-8小时 |
24小时 |
8小时 |
|
工作溶液稳定性 |
室温24小时 |
室温24小时 |
室温8小时 |
|
贮藏液存放时间 |
室温1年 |
室温1年 |
室温6个月或4°C一年 |
|
推荐印迹膜 |
硝化纤维 |
硝化纤维或PVDF |
硝化纤维或PVDF |
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SuperSignal@West Pico 化学发光底物 |
|
特征
优点 |
经济：比任何其它化学发光底物产品花费更少。
更长发光时间：强光发射超过一个工作日，获得你想要曝光次数。
高强度：信号比其它基于发光胺的系统强两倍。
皮克级灵敏性：高度灵敏性可快速显色较宽水平范围内的蛋白质。
优良的稳定性：24小时工作溶液稳定性；在运输条件环境下至少可稳定1年。 |
|
SuperSignal@ West Dura 持久性化学发光底物 |
|
特征
优点 |
24小时发光时间：比任何其它改良的HRP化学发光底物提供的要长10倍；为发表质量的印迹提供更多的曝光
极好的灵敏度：具前所未有的10-15克级灵敏度
节省抗体：使用Super Signal âWest Dura 伸展持续期底物比用其它化学发光底物，抗体稀释度可高得多。
立即产生强烈信号，易被胶片或化学发光检测系统检测
工作浓度至少稳定24小时；试剂盒在运输条件下可稳定至少一年 |
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SuperSignal@ West Femto 最高灵敏度化学发光底物 |
|
特征
优点 |
释放由化学发光系统产生的最强信号；使胶片或图象仪系统成像更容易达到可能检测蛋白质的最低限：10-15克
经济：使宝贵的一抗稀释度可达1/100,000 |
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Lumi-PhosTM West Blotting 化学发光底物 |
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PIERCE 基于碱性磷酸酶检测系统的化学发光底物，其同时具有两个特色：高强度信号和较低的背景。 |
定货信息
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目录号 |
产品名称 |
包装 |
价格 |
|
SuperSignalâ West Pico化学发光底物 |
|
34080 |
SuperSignalâ West Pico Chemiluminescent Substrate |
500ml |
2178 |
|
34077 |
SuperSignalâ West Pico Chemiluminescent Substrate |
100ml |
647 |
|
34079 |
SuperSignalâ West Pico Chemiluminescent Substrate Trial Kit |
50ml |
383 |
|
SuperSignalâ West Dura持久性化学发光底物 |
|
34075 |
SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate |
100ml |
3643 |
|
37071 |
SuperSignal® West Dura Extended Duration Substrate Trial Kit |
20ml |
805 |
|
SuperSignalâ West Femto最高灵敏度化学发光底物 |
|
34095 |
SuperSignal® West Femto Maximum Sensitivity Substrate |
100ml |
3828 |
|
34094 |
SuperSignal® West Femto Maximum Substrate Trial kit |
20ml |
950 |
4. Western Blotting检测试剂盒
我们开发了此步免疫检测的完整的试剂盒,即HRP标记的二抗检测系统(含封闭液,洗液,底物,HRP/亲和素-二抗),您只需准备好一抗,并选择和一抗动物来源相应的试剂盒就可以.对于实验来说,采用完整的试剂盒可以避免各种试剂的不匹比而带来的结果不理想.
Western Blotting DAB显色法检测试剂盒
试剂盒的内容：
（1） 封闭试剂：10g蛋白质干粉2包。
（2） 浓缩抗体稀释液：20ml×2瓶，为10倍浓缩液。
（3） 过氧化物酶标记二抗。1ml。效价1：200—400
（4） DAB浓缩液10ml(×40倍)
购买信息:
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Western Blotting DAB显色kit（大鼠IgG） |
SA2023 |
国产 |
盒 |
550元 |
|
Western Blotting DAB显色kit（山羊IgG） |
SA2021 |
国产 |
盒 |
550元 |
|
Western Blotting DAB显色kit（兔IgG） |
SA2022 |
国产 |
盒 |
550元 |
|
Western Blotting DAB显色kit（小鼠IgG） |
SA2020 |
国产 |
盒 |
550元 |
|
SuperSignal West Pico His蛋白Western检测试剂盒 |
15168 |
Pierce |
盒 |
3268元 |
|
CL-Xposure X 光胶片(5”x7”) |
34090 |
Pierce |
100张 |
1054元 |
|
CL-Xposure X 光胶片(8”x10”) |
34091 |
Pierce |
100张 |
2121元 |
|
柯达X 光胶片(5”x7”) |
|
合资 |
100张 |
200元 |
|
暗盒(5”x7”) 含增感屏 |
|
国产 |
|
650元 |
|
显影粉 |
|
国产 |
瓶 |
8元 |
|
定影粉 |
|
国产 |
瓶 |
8元 |
注: 每盒足够10张膜或800平方厘米的膜显色, 表中所列动物IgG是指一抗的种属来源.
蛋白质的检测与分析