第三章 思考题（Pr.分离纯化）

1.盐溶、盐析、亲和层析、PAGE，浓缩效应，电荷效应，分子筛效应。

2.如何理解分子筛分离pr的原理。小的进大的流

3.有机溶剂分级分离pr的基本原理。

4.据支持物不同，电泳可分为哪几种类型？滤纸电泳、醋纤膜电泳、薄层电泳和凝胶电泳

5.常用的选择性吸附剂有哪几种？

6.哪些物质可作用蛋白质亲和层析的配体？抑制剂、效应物、酶的辅助因子、类似底物、抗体或其他物质（如外源凝集素、金属离子等）；

7.测定pr分子量有哪些方法？Ⅰ. 渗透压Ⅱ. 沉降平衡Ⅲ. 凝胶过滤层析Ⅳ. SDS-PAGEⅤ. 激光解吸电离飞行时间质谱

8.聚焦法测定pr的pI的基本原理。

等电聚焦的分离原理是在凝胶中通过加入两性电解质形成一个不连续的pH梯度，两性物质在电泳过程中会自动集中在与其等电点相应的pH区域内，从而得到分离

9.可用哪些方法来分要蛋白质的N-末端和C-末端AA。

化学法：二硝基氟苯法（DNFB ）丹磺酰氯法（DNS-Cl）异硫氰酸苯酯法（PITC）

酶法--氨肽酶法（amino peptidase）

化学法--肼解法（hydrazinolysis）  酶法--羧肽酶法（carboxypeptidase）

10如何理解凝胶过滤层析中kd=0时，kd=1时，0<kd<1，目标分离物的分离状况。Ve=Vo+kd•Vi

第四章  蛋白质的转运、加工与修饰名词及符号：

翻译同步转运、首先在游离核糖体中合成N-terminus信号序列（即内质网信号序列），然后信号序列介导核糖体与内质网膜结合，使新生肽链边合成边进入内质网腔（ER lumen）或插入内质网膜

翻译后转运、指游离多聚核糖体上合成的蛋白质的运输（1）转运到线粒体（mitochondria）（2）转运到叶绿体（chloroplast）（3）转运到过氧化体（peroxisome） （4）转运到细胞核

信号肽、13-36个氨基酸残基组成，一般位于 N-terminus，含有一个或两个带正电的氨基酸残基，后面是连续的10-15个疏水性氨基酸残基，靠近信号切割位点有一短的极性氨基酸序列，在切割位点最近处有短侧链氨基酸（如Ala）

易位子、由于新生肽链N-terminus带有正电荷，不易进入疏水的内质网膜。所以要完成蛋白质的转运，需要内质网膜提供一个水相通道。这个水相通道就是易位子。连接转移链膜蛋白:TRAM蛋白至少跨膜8次，能与新生肽链进行交联Sec61蛋白:易位子通道的主要蛋白成分。这个复合物能与核糖体大亚基紧密结合，从而把核糖体与内质网膜连接起来

SRP、SRP信号识别颗粒是一种核糖核蛋白，由6条多肽链P54 ,P9/P14 ,P68/P72 ,P19及含300个核苷酸的7S小RNA组成.

Ⅰ、II型膜蛋白、Ⅰ型膜蛋白的C-terminus在细胞液，如胰岛素受体。 Ⅱ型膜蛋白 N-terminus 在细胞液，如脱唾液酸糖蛋白（asialoglycoprotein

内部信号序列、某些膜蛋白的肽链内部具有确定肽链在膜上的方向的信号序列,称内部信号序列，该序列最终不被信号肽酶切除，插入膜时总是正电性强的一端朝向胞液。

分子伴侣、hsp70、内体、靶向序列、靶向班块、网格蛋白、包被体、

停靠蛋白、信号识别颗粒受体，由两个亚基组成： β为膜蛋白，含 300 个氨基酸残基；α是膜周边蛋白，含 640 个氨基酸残基，负载着GDP，并且有 GTP 酶活性。功能: 与SRP结合并起始肽链向内质网膜转运；使肽链的延长继续进。PDI、ARF、COP、

Tom、存在于线粒体外膜 Tom40 嵌入在膜内，形成转运通道Tom 37,70,71 识别少量含有内部信号序列的蛋白质Tom 20/22 复合物识别蛋白质的 N-terminus 信号序列Tom 5,6,7 可能是通道的组成成分，也可能是通道的组装因子 Tim（线粒体蛋白转运的受体蛋白，参与形成内膜通道）Tim 17/23：转运进入线粒体基质的蛋白质Tim 22/54：转运定位在内膜上的蛋白质；Tim 44： 分别与 Tim 17/23 和 Hsp70 结合。这种结合使蛋白质一进入基质就结合到 Hsp70 上；Tim 9/10 和 Tim 8/13： “护送”从 Tom 运出的蛋白质到 Tim。内质网分拣信号（KDEL）、内质网蛋白含有特异的 C terminus 分拣信号 Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL），

核定位信号（PKKKRKV）、过氧化体分拣信号（SKF）、线粒体基质信号（N-端15-35AA形成两亲a螺旋或b折叠）、溶酶体分拣信号（M6P）、停止转运-锚定序列、信号-锚定序列、组成型分泌、调控型分泌、易位子泛蛋白、

胞转作用（一种跨越细胞的运输过程，即在细胞的一侧通过胞吞作用使物质进入细胞，然后在另一侧胞吐将物质分泌到细胞外）。蛋白体（ptoteasome）、错误折叠和多亚基蛋白质的未组装亚基往往通过易位子运回细胞质，然后在蛋白体（ptoteasome）中降解，

内切蛋白酶、酶能识别蛋白质前体中 ArgArg、LysArg、LysLys 等双碱性氨基酸残基序列，在该序列的 C terminus 切断肽链外切蛋白酶

2．Ⅰ、Ⅱ型膜蛋白形成机制：

一胰岛素受体含一个N-terminus信号序列和一个停止转运蛋白-锚定序列& 22 个疏水氨基酸，停止转运-锚定序列，进入易位子后能阻止新生肽链向内质网转运。&肽链合成结束后，停止转运-锚定序列从易位子中移动出来，接着锚定在磷脂双层中

二脱唾液酸糖蛋白含有一个信号-锚定序列，引导新生肽链进入内质网，但信号序列的N-terminus在细胞质&信号序列进入易位子后，C 端肽链继续合成，逐步进入内质网。核糖体始终结合在内质网膜上，直至蛋白质合成结束

2、蛋白质的修饰包括哪些内容。

1）氨基酸残基的修饰：氨基的甲基化和乙酰化；② 羧基末端的酰胺化③ 磷酸化④ 谷氨酸残基的 γ 羧基化修饰⑤ 脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化与蛋白质分子内和分子间的共价交联⑥ ADP 核糖基化。（2）蛋白质与膜中脂类共价结合（3）肽链中 L 氨基酸的 D 构型化

3、决定蛋白质半衰期的因素及泛素化作用。

细胞中蛋白质的半衰期是由它的氨基酸末端残基决定的。&如N－末端Met的酵母蛋白质半衰期大于20 Min，而Arg取代则为2 Min。& Arg 、Asp使N－末端不稳定便于泛素化，而Met 、Ser则相反。

泛素 C terminal Gly 的羧基能与靶蛋白质中 Lys 残基的 ε 氨基形成肽键，使泛素与蛋白质共价结合。&多聚泛素的蛋白质进入胞质中的蛋白体（proteosome）然后被其中的蛋白酶降解。需要 ATP 供能。

4、受体介导的内化的生物学意义。

⑴将胞外代谢物运输到胞内。如铁离子、LDL、维生素 B12 等⑵是细胞应答肽类激素和生长因子的调节方式之一。通过胞吞作用使细胞表面受体数目减少，使细胞对激素及生长因子的应答减弱，称为受体的下降调节⑶将需要降解的蛋白质通过内吞作用进入细胞后转运到溶酶体。如巨噬细胞清除血液循环中被损伤的蛋白质⑷某些病毒或细菌毒素能通过这种作用进入细胞。如 HIV病毒、白喉毒素等

5、简述翻译同步转运和翻译后转运的基本内容。

6、如何理解小泡介导的蛋白质转运的“生物膜不对称性”的意义。

7、简述SRP介导的蛋白质转运。

第五章 免疫球蛋白

1、Ig, V区，C区，抗原决定族，D基因，J基因，

超变区(补体决定区，CDR), 轻链有3个特殊易变部位，在第30位、第50位和第100 位氨基酸残基附近；重链有4个特殊易变部位，在第 30、50、80和第100位氨基酸残基附近。这些部位称为超变区或互补决定区

类别转换(CH启换)，B 细胞最初表达 IgM 和/或 IgD，然后 DNA 进一步重组，先重组的 VHDHJH 基因片段可在不同的 CH 基因之间转换，使 B 细胞经过同一抗原刺激后合成具有不同 C 区的各种类别 Ig

12－23bp规则，茎环结构，去环缺失模式，V基因下游和J基因上游通过保守序列七聚体之间和

九聚体之间的互补形成茎环结构。茎状部分将经过选择的V基因片段与J基因片段靠拢，其余的V 和J 基因片段位于环状部分。在重组酶作用下，切除茎环部分的 V、J 基因片段，重新连接 V、J 基因形成新的DNA序列。这一机制称为去环缺失模式

2、描述Ig四链单位的分子特征(结构域，功能域)、补体(存在于血清和组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质）

各种不同类别的Ig都含有4条多肽链组成的基本结构单位，即2条相同而分子量较大的重链（H链）和2条相同而分子量较小的轻链（L链）；重链和轻链之间以及重链和重链之间均借链间二硫键共价结合和分子内非共价稳定的Ig分子结构；在重链上尚结合着糖链，故Ig又属糖蛋白

轻链和重链一级结构的氨基酸序列差异，可分为可变区（variable region,V区）和恒定区（constant region, C 区）V区氨基酸高度变异，而C区氨基酸基本恒定； V区和C区三级结构保持相对独立，各自通过一个链内二硫键形成一肽环，肽环内含 60－70个氨基酸残基，每一肽环又与其周围肽段紧密折叠成球状的结构域；轻链有 2 条链内二硫键，分别组成 VL 和 CL 2 个结构域；重链有 4-5 条链内二硫键，分别组成  4-5 个结构域，即 VH、CH1、CH2、CH3 和 CH4（ IgA、 IgG 和 IgD 有 3 个 CH  结构域； IgM 和 IgE 有四个 CH  结构域

功能区  成 分      功               能

  V 区   VH/ VL     与相应抗原的决定簇发生特异性结合

  C1 区      CL/ CH1     与补体中 C4b 结合

  C2 区      CH2/ CH2  激活补体 C1q 和控制体内 Ig 代谢降解速率

  C 3 区     CH3/ CH3  具有亲细胞性，与细胞表面 Fc 受体结合

3、如何根据Ig分子的V区和C区的结构变化，将Ig分子的变异体分成类、亚类、型、亚型、群和亚群。

类:Ig不同类的抗原性差异存在于H链的恒定区(CH）亚类:同一类Ig中，存在于铰链区氨基酸组成和二硫键数目的差异。根据重链和轻链之间二硫键连接位置差异和重链之间二硫键数目不同可将同一类 Ig 分子分成几种不同的亚类。型:决定Ig型的抗原性差异存在于L链的恒定区。 亚型:位于λ轻链恒区（C2）。根据 Ig 的 λ 链 C 区中个别氨基酸残基不同可将 λ 链分成 4 个亚型。

群：据同一类Ig V区的同源性将其分成3群。亚群：通过 Ig 各群的 V 区氨基酸组成和序列比较，发现从 N 端起前 20 个氨基酸的序列变异较大，而其他位置上的氨基酸序列相对稳定。因此又可将群分为亚群。

4、如何从基因水平上解释Ig的多样性。

一重链 VDJ 和轻链 VJ 片段的重组连接

肽链的编码基因可分为编码 V 区和编码 C区的两大部分，V区基因的下游是编码C区的基因；V基因是由少数分隔的种系基因片段, 在 T、B淋巴细胞发生过程中通过程过重排的组合、拼接而成，从而产生巨大数量特异的抗原受体以识别不同的抗原。重链 V 区基因是由三种种系基因片段：V、D、J 轻链V区基因由V、J两个基因片段拼接成的，种系基因结构中 V、D、J 片段各有多个，但一个淋巴细胞细胞中只有一个片段参与组成抗原受体 V 区的编码基因拼接而成。

Ig 基因均保存着各自的种系构型，如重链和轻链的 V 区都来自每一基因库中的多基因片段。单一基因片段经过选择性DNA 重排组成功能性基因在 B 淋巴细胞分化期间，重链基因首先组合，并分成两个阶段进行重排：第一阶段为 D