农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

准备：

　　1．灭菌试管400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。

　　2．试剂：YEP1200ml（每瓶300ml共4瓶）+Kan1;1000，Rif1:500。

　　1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。

　　步骤：

　　共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g离心10min。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600约为0.8--1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。

　　注意：

　　1．选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%。

　　2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。

　　3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。

　　4．转化过程略，视苗的长势弱0.8Pa3`，长势好的0.8Pa5`。

　　5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。