中间孔含A,B,C三种抗血清，a、b和a、c为不同型的抗原（呈双线或交叉），b、c为同一血清型的不同亚型（部分融合，有交叉）
2．用做血清流行病学调查时，将标准抗原置中心孔，周围1、3、5孔加标准阳性血清，2、4、6孔分别加待检血清。待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交叉者判为阴性。待检孔虽未出现沉淀带，但两阳性孔的沉淀带在接近待检孔时，两端均内向有所弯曲者判弱阳性。若仅一端有所弯曲，另一端仍为直线者，判为可疑，需重检。重检时，可加大检样的量。
检样孔无沉淀带，但两侧阳性孔的沉淀带在接近检样孔时变得模糊、消失，可能为待检血清中抗体浓度过大，致使沉淀带溶解，可将样品稀释后重检。
3．用以检测的抗血清的效价时，将抗原置中心孔，抗血清倍比稀释后置周围孔，以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为该抗血清的琼扩效价。
（四）注意事项
1．不规则的沉淀线可能是加样过满溢出、孔型不规则、边缘开裂、孔底渗漏、孵育时没放水平、扩散时琼脂变干燥、温度过高蛋白质变性或未加防腐剂导致细菌污染等所致。
2．抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多，沉淀带向抗体孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀释度的反应液试验后调节。
四、琼脂扩散试验诊断马传染性贫血病
（一）材料与试剂
1．精制琼脂粉
2．打孔器、加样器、平皿
3．标准阳性血清和标准阴性血清，由指定的生物制品厂购买。
4．马传染性贫血病琼脂扩散用抗原，由指定的生物制品厂购买。
5．pH7.4PBS液
（二）操作方法
1．取琼脂粉1g，加含有1/万硫柳汞的PBS液100ml，水浴加热使之完全融化。
2．取平皿（直径9cm），将融化的琼脂倒入，每个平皿倒入15ml～18ml，使其厚度约
为2.5mm，冷却后加盖，放入4℃～8℃冰箱内，至少4h。
3．按7孔梅花图案打孔，中央孔一个，孔径4mm，外周孔6个，直径6mm，孔距8mm
（中间孔至外周孔的中心距离），封底。
4．中央孔加抗原，2、5号孔加标准阳性血清，其余1、3、4、6孔分别加被检血清，加满为止。加毕后，平皿加盖，平放入铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘内，置15℃～30℃条件下孵育。每日观察一次，连续3天。
（三）结果判定
当标准阳性血清孔与抗原之间出现一条明显致密的沉淀线时，再进行被检血清孔的判定。
阳性：被检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线，或者标准阳性血清的沉淀线末端向内弯向毗邻的被检血清孔。
阴性：被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，且标准血清阳性孔与抗原孔之间的沉淀线直向毗邻的被检血清孔。
可疑：标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端似乎弯向毗邻被检血清孔，但不易判断。此种结果判为可疑。可疑结果必须进行复试，将抗原做2×，4×，6×，8×等倍数稀释，进行琼脂扩散，观察时间可延长至5d，最后判定结果。
SPA标准菌种
1．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同，见图3-1。