HRP催化的酶促反应第一步是特异性的—酶催化底物H2O2，其余反应是非特异的，可用各种电子供体介导，所以选用不同的电子供体，可使终产物呈不同颜色，例如：CN（4—Chloro—1– N aphthol）为蓝黑色，TMB（Tetramethyl—Benzidine ）为深蓝色，AEC（3—amino—9– ethyl--carbazole）为红色。市售试剂盒所配显色液以AEC居多，室温下较稳定，但不能进行脱水等处理，且时间长易褪色。DAB是广泛应用的电子供体之一，较敏感，切片可脱水透明、半永久保存，且终产物具有嗜饿性，经O2O4处理，电子密度增加，适于电镜下确定抗原的存在部位。但是DAB被认为可能具有致癌性，所以应尽量减少吸入和接触次数，最好将DAB制成10倍贮存液，分装于-20℃保存，应用时稀释、过滤。与DAB比较，CN敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。

　　（2）ALP，是以As-Mx为底物，FB/FR为发色团，生成蓝色/红色不溶性沉淀。ALP标记抗体主要用于内源性过氧化酶含量较高的血细胞、淋巴细胞等的ICC染色。显色液内加入终浓度为2～4mmol/l 的levamisole, 大多数内源性ALP活性可被抑制。通常左旋咪唑（levamisole）以每毫升60～120mmol/L浓度的贮存液-20℃冰箱保存。应用时稀释30倍。为避免反复称取，试剂吸水，As-Mx、FR、FB试剂均应小量分装后-20℃冰箱保存，左旋咪唑能抑制内源性碱性磷酸酶活性。例如：以每次所用显色液30ml计算，分装As-Mx 5～7mg/支、Fr 8mg./支、FB7mg/支，每次使用一支，用前稀释30倍，过滤显色 。FR、FB等在光照射条件下易引起沉淀，故显色反应在暗处进行。

　　（3）GOD，是以葡萄糖为底物的酶，其显色方法为β-D-葡萄糖67mg、NBT6.7mg、PMS（Phenazine Methylsulfate）0.167mg,0.05mol/L PB(pH8.3)10.0ml,37℃孵育1h。生成蓝色不溶性沉淀。该终产物不溶于有机溶剂，切片可脱水透明，长期保存。但GOD的敏感度较HRP和ALP为低，电子供体少，应用较局限，主要用于两种酶的放大技术，能提高方法和敏感性和特异性。即用GOD和HRP分别标记第二、第三抗体（例第一抗体为小鼠单克隆抗体、第二抗体为GOD标记的兔抗鼠IgG，第三抗体则为HRP标记的羊抗兔IgG），ICC染色，以葡萄糖-DAB作显色剂。基本原理如（图4-3）。在这里HRP是作为第二酶系统，利用葡萄糖氧化时生成的H2O2作底物，催化酶促反应，不受内源性过氧化酶的影响。而且GOD和HRP所标记的抗体是结合在同一抗原位置，所以能良好地显示组织抗原的存在。其主要染色步骤为：

　　①切片经第一抗的孵育；②漂洗，GOD标记的第二抗体孵育40～60min（室温）；③漂洗，HRP标记的第三抗体孵育30～45min（室温）；④漂洗，显色、脱水透明观察同前。

图4-3　两步酶催化反应原理

　　二、非标记抗体酶法

　　由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法）。现分述如下。

　　（一）酶桥法

　　1．基本原理　　首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节　省第一抗体的用量。

　　2．染色步骤 主要程序如图4-4

图4-4　酶桥法主要染色步骤