m直接免疫荧光法的注意事项 (续)
¨  一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象；
¨  经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
(2) 间接法又称为荧光抗-抗体法
j 需要两种抗体参与，即一抗和二抗(荧光素标记)。一抗对标本中的抗原来说起抗体的作用，但对荧光标记的二抗来说又起着抗原作用。
–    可用来检测标本中未知抗原，也可检测血清中未知抗体。
k间接免疫荧光法操作步骤
¨         标本的处理及非特异染色的封闭同直接法；
¨         一抗染色：
–         加未标记的特异性抗体(通常1:100稀释，用0.01MpH7.4的PBS稀释)，37℃作用30min或4℃过夜。
¨         0.01M PBST漂洗5min×3次(震荡漂洗)； 
k间接免疫荧光法操作步骤(续)
¨   加荧光标记的二抗抗体，37℃湿盒避光作用30min。
¨  0.01M PBST避光漂洗5min×3次(例如包上锡纸，在摇床上漂洗)；
¨  甘油缓冲液封片
¨  镜检
 
¨  优点：敏感性较高，比直接法高10倍左右；制备一种荧光标记抗体，可应用于多种一抗；
¨  缺点：是参加反应的因子较多，产生非特异性染色的机会增多。
m间接免疫荧光法的注意事项
¨  荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长 ，会使荧光减弱。
¨  每次试验时 ，需设置以下三种对照： 
–   阳性对照：阳性血清+荧光标记物
–   阴性对照：阴性血清+荧光标记物 
–   荧光标记物对照：PBS+荧光标记物 
m间接免疫荧光法的注意事项(续)
¨  标本片需在操作的各个步骤中，始终保持湿润，避免干燥。
¨  一抗和二抗应始终保持在标本片上，避免因放置不平使液体流失，从而造成非特异性荧光染色。 
  (二)  免疫酶酶标法
【原理】
¨  以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位；
¨  酶降解底物的量与色泽浓度成正比。可反映被测定的抗原或抗体的量。
1、常用的标记酶及其显色底物
¨  辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物
¨  碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物
(1) 辣根过氧化物酶(HRP)及底物
¨  HRP是应用最广的一种酶，来源于植物辣根，由无色的酶蛋白和深棕色的铁叶琳结合而成，分子量约40kDa，稳定性好；
¨  底物为过氧化物和供氢体(DH₂)
–   过氧化物：常用过氧化氢和过氧化氢尿素。
–   供氢体：多用无色的还原型染料，通过反应生成有色的氧化 型染料，最常用的供氢体是DAB。
DAB (二氨基联苯胺)
¨  DAB本身无色，反应后呈棕色，不溶于水，不易褪色，电子密度高，最为常用。
¨  目前已经有商品化的试剂盒，使用起来非常方便。
(2)  碱性磷酸酶(AP)及底物
¨  AP为磷酸酯的水解酶，可通过两种反应显色：
–   偶氮偶联反应，底物为a-萘酚磷酸盐，经水解后得a-萘酚，与重氮化合物如坚牢蓝(fast blue)或坚牢红(fast red)形成不溶性沉淀，分别呈兰色或红色。
–   靛蓝-四唑反应：底物为溴氯羟吲哚磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，经酶水解并氧化形成靛蓝，而氮蓝四唑(NBT)在此氧化过程中被还原成不溶性紫兰色沉淀。
2、常用的免疫酶染色方法
¨   又分为以下两种方法：
–   酶标抗体法
•   直接法
•   间接法
–   非标记抗体酶法
•   酶桥法
•   PAP法