（六）底物：各种酶都有对底物的特异性，所以使用不同种类的酶要求有不同的底物。一旦酶结合物已经确定（如AP或HRP），那么可供选择底物的范围是很有限的。在这有限底物的范围内如何选择合适的底物呢？应按下列几个条件进行选择。
（1）底物在未被酶催化以前应该是无色的，而经酶催化后有明显的颜色变化，这样可使结果分辨清楚；（2）所显色泽易干洗脱；
（3）显色后的产物要求稳定，在作定量测定时所产生的有色物质应该是可溶性的；
（4）价廉，易得而且无毒。
因此，对AP酶结合物来讲，一般均用硝基苯磷酸盐，显色后呈桔黄色，色泽稳定，用2 mol/L NaOH终止反应，可用波长403nm测定O.D值。AP催化底物产生颜色的反应如下：

因AP是一种磷酸酯酶,它能催化磷酸酯(硝基苯磷酸盐)水介释放出无机磷酸而显色。
对HRP酶结合物来说，主要通过酶的催化作用使过氧化氢还原。同时使另一个底物氧化产生色变，可供选择的底物有几种，过去都用5-氨基水杨酸，它经酶催化后产生棕色产物便于观察，缺点是容易产生沉淀，用于定量测定时有困难。目前大多数使用邻苯二胺（Ortho-Pheny lene-diamine，简称OPD），稳定、敏感，其降解产物呈桔红色，可溶。用2 mol/L H₂SO₄或柠檬酸终止反应，可在492nm波长的酶标比色计上测定O.D值，也可目测。HRP在催化反应中可使H₂O₂分解出新生态氧，本身还原成水，而使OPD氧化生成有色产物，反应式如下：

O.P.D对光不稳定，故加后需放暗处作用，但据报告有致突变性，使时需注意。此外尚可选用邻联甲苯胺（Ortho-Toli dine，简称OT），显色以后呈兰色，可用波长630nm测O.D值，不需终止反应。也可用目测，但显色后不稳定，40分钟色泽会自行减退，故需及时测定结果。加终止剂后呈现黄色，则需用波长405nm测定O.D值。
底物配制方法如下：
1、用O.P.D作底物：先配制PH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。取0.1 mol/L（19.2克/升），柠檬酸溶液24.3ml，加0.2 mol/L（27.4克/升）Na₂HPO₄溶液25.7ml，再加蒸馏水50ml，然后将40mgO.P.D溶解其中，再加30% H₂O₂ 0.10ml即可应用，用时新鲜配制、避光。
2、用OT作底物，先配PH3.7的醋酸盐缓冲液，取0.2M醋酸（12ml/升）和醋酸钠（16.4克/升）溶液等量混和，然后称取OT 21.2mg先溶于1ml二甲基乙酰胺中，再将OT溶液倾入100ml PH3.7的醋酸盐缓冲液中，并加入30%H₂O₂ 0.05ml即得，用前新鲜配制。
（七）作用时间：加底物后要多长时间终止反应测定结果呢？一般可采取二种方法。
1）任意确定一个时间，如20分钟或30分钟终止反应，测定被检标本和阳性参考标本的O.D值。这样所得的数据要进行校正，校正可按下列公式：

2）制备好一批酶结合物后预试时间，在反应温度固定时，当阳性参考血清O.D值达到1.0时终止反应，记录这个时间，如30分钟，以后用本批酶结合物测定待检样品时都采用同一时间终止反应，这个办法不需要校正，比较方便。
国外在使用自动测定仪时，加底物后随时测定，每块试验板上阳性参考血清的O.D值，当其达到1.0时，立即将全板上被试标本终止反应进行测定，这样所得结果比较一致。我国也有自动酶标测定仪，但由于固相载体不够均匀，也很难用板来直接测定。
在ELISA中所加酶结合物之浓度，加后孵育时间以及加底物后孵育时间。这三个因素也是互相有影响的。一般讲，酶结合物浓度低，则要求孵育时间长些，而酶结合物浓度高则要求孵育时间短些，可根据实验的具体情况，变更不同因素，以取得良好的结果。
由于ELISA中变异因素多，对于要诊断某一疾病时，必须进行一系列实验室预试，摸索，或叫实验研究，在酶结合物已经确定的情况下，一般要求预测以下5个条件：
（1）抗原包被浓度；
（2）被检血清稀释度，即测剂量反应曲线；
（3）第一抗体作用时间；
（4）酶结合物作用时间；
（5）底物作用时间。
一旦试验条件摸清，以后在正式测定时，必须固定条件，不要随时改变，以使试验系统保持足够的稳定性。