2.pH8.6硼酸缓冲液,离子强度0.05Mol/L 硼酸 6.70g 硼砂(Na2B4O7·10H2O) 13.40g H2O 加至 1 000ml 缓冲液配制后,加万分之一的硫柳汞防腐。两侧电泳槽加缓冲液至2/3~4/5的槽体积,注意两侧一样多,以免造成液面差,产生虹吸作用,影响电泳。 当蛋白质泳动至槽内后,就应该更换缓冲液。有人认为长久电泳过的电泳液易于把血清中各成分分开,而新配制的则差一些。为了防止缓冲液离子强度的改变,可以在每次电泳时更换正负极(这是目前广泛采用的);也可以在下一次电泳前,将两槽内的缓冲液混合后再用。但也有人认为不能混合再用,必须更新。 (六)电场强度的显示 以V/cm长或I/cm宽表示。电压的测量必须用电压表测量凝胶板两端的电压差,再除以板长,而不能以电泳仪上的电压数表示,当然这两者有一定的相关性。电泳仪上的电流强度除以凝胶板宽即可代表电场强度。在实际工作中,很难有两项指标都符合的调控,因此只能根据取其一个指标进行调控,一般多按电流计算。 (七)结果观察与标本的保存 对于与免疫有关的电泳,一般能形成明显的抗原抗体复合物,因此可以直接观察。也可以染色观察。染色后同时也起到了保存标本的作用。具体步骤如下: 1.将琼脂板放入生理盐水中4℃浸泡2天~3天,每天换液数次,以洗去多余的蛋白质。 2.染色 将洗好的琼脂板放入氨基黑或偶氮胭脂红染色液中染色15min~30min。 0.5%氨基黑染色液的配制: 氨基黑4B(10B也可) 0.50g 甲醇 5ml 冰醋酸 10ml H2O 40ml 0.75%偶氮胭脂红染色液的配制: 偶氮胭脂红 1.50g 甲醇 100ml 冰醋酸 20ml H2O 80ml 先将染料放入研钵中,边研磨边加甲醇,使染料充分溶解,再加冰醋酸,最后加蒸馏水,以滤纸过滤,置棕色瓶保存。 3.脱色 染色后,将琼脂板放入脱色液中脱色,至琼脂板底色脱净为止,脱色液要勤换。 脱色液的配制: 乙醇 45ml 冰醋酸 5ml H2O 50ml 脱色液用过后,可用活性炭吸附染色颗粒,过滤后,可再使用。 4.漂洗 用蒸馏水漂洗。 5.制膜 把琼脂胶滑到玻璃纸上,下垫一玻璃块,展平玻璃纸。在琼脂表面上抹一层甘油(以防干裂),放37℃温箱烘干即可。也可以先制膜后染色。 对于非免疫性电泳标本的染色基本同于免疫电泳。但不要进行漂洗,电泳后直接投入染色液中或固定后投入染色液中。 6.标本的保存 主要是染色后拍照保存,也可制膜保存。 (八)电泳的分类 1.根据支撑物的不同可分为: ⑴凝胶电泳:如琼脂电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 ⑵纸或纤维素膜电泳:如滤纸电泳、醋酸纤维膜电泳、硝酸纤维素膜电泳等。 ⑶粉末电泳:如淀粉、纤维素粉电泳等。 2.根据电场强度的不同可分为: ⑴低压电泳:电场强度1V/cm~5V/cm,电泳时间较长,可数小时至十几小时。 ⑵中压电泳:电场强度5V/cm~20V/cm,电泳时间一般数分钟至数十分钟。 ⑶高压电泳:电场强度20V/cm~200V/cm,电泳时间短,一般为数分钟至数十分钟。 3.根据离子强度的不同而分为: ⑴连续电泳:是指电泳槽缓冲液的类型与离子强度和玻璃板上支撑物的一致。 ⑵非连续电泳:使电泳槽内缓冲液的类型与离子强度和玻璃板上支撑物的不一致。一般常采用琼脂板的离子强度为电泳槽的一半。 4.根据电泳的目的可分为:区带电泳、免疫电泳 胞电泳等 5.根据形状可分为火箭电泳、圆盘电泳等。
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