适当的振荡可使醛化剂与红血球充分接触，并可排除凝块形成。但过分地振荡，则易产生气泡，引起红血球变形。
3．红血球鞣化 多糖、脂多糖、类脂等一些半抗原易于吸附红血球表面，所以一般醛化处理即可。但对于许多蛋白质抗原，由于不易吸附于红血球表面，所以在醛化的基础上，必须再以一定浓度的鞣酸进行处理，强化它对蛋白质的吸附能力。
有人认为双醛化后可不必进行鞣化。首都医院做了“丙酮醛＋甲醛＋鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多数意见认为醛化后仍需鞣化比较好。
(1) 鞣化过程：①将10％醛化红血球用生理盐水洗涤2次，再以0.15Mol/L pH7.2PBS洗涤1次，最后以PBS配成2.50％悬液；②称取优质鞣酸20mg，以生理盐水4ml配成1﹕200的浓度，于37℃水浴，使之充分溶解，然后再以pH7.2PBS稀释成1﹕2 000的浓度。当天配制、当天用完；③1份2.5％红血球悬液与1份1﹕2 000鞣酸液充分混合，37℃水浴10min，1 500r／min离心，去上清，用PBS液洗涤1次；④以0.02％牛血清白蛋白PBS液洗涤1次，最后以牛血清白蛋白PBS配成2.5％鞣化红血球。
（2）影响鞣化的因素：①鞣酸的质量：这是很重要的，所以必须采用优质鞣酸。分析纯的鞣酸呈面包屑状，不呈面粉状，有折光性；②鞣酸的浓度：浓度过高，可以出现红血球的凝集现象；浓度过低，达不到红血球的活化作用。醛化过的红血球所采用的鞣酸浓度一般比新鲜红血球高10倍。通常以1：2 000为佳；③鞣化时间：鞣化过程一般10min～15min即可完成。时间再长也不能吸附更多的抗原，提高血凝滴度。鞣化时采用的pH对吸附抗原和血凝滴度影响不大，一般采用pH7.2的PBS液。
（四）红血球的致敏
1．致敏抗原剂量的确定 一般而言，在一定的范围内，抗原的浓度与试验的敏感性呈正比，超过这个范围，再增加抗原，敏感性不会再提高，而且过大，有时会引起非特异性凝集。当采用一种新的抗原时，必须经过试验，选择适当的抗原致敏浓度，即把抗原稀释成几个不同的浓度分别致敏红血球。再用这些致敏红血球分别与标准阳性血清进行试验，与标准阳性血清呈最高滴度的阳性反应的最小抗原剂量，即为该抗原的单位计量。致敏时，根据不同的抗原，可采用2～4个单位计量进行致敏。
2．致敏方法 各种抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白质的致敏方法如下：
所需浓度的抗原 1 份
pH6.4PBS液 4 份
2.50％的鞣化红血球悬液 1 份
混匀，置37℃水浴30min，离心，沉淀后，以2.5％兔血清生理盐水洗涤1次，悬浮于1份兔血清生理盐水中。
3．影响红血球致敏的因素
⑴要有高纯度或高效价的抗原或抗体。
⑵被致敏抗原或抗体的适当剂量和浓度。如抗体一般以μg/ml IgG为宜。抗猪瘟IgG一般用80μg/ml～160μg/ml，抗口蹄疫IgG 20μg/ml~40μg/ml，抗猪水泡病IgG 130μg/ml~160μg/ml，抗猪肺疫IgG 30μg/ml ~40μg/ml，抗猪弓形体20μg/ml~40μg/ml，抗原一般用0.2mg/ml～1mg/ml。
⑶pH：除鸡卵蛋白采用4.6～5.1外，其它通常采用5.6～6.4，高于7.2或低于4.6均可使红血球发生自凝。
⑷致敏温度：一般为37℃，范围是20℃～40℃。
⑸致敏时间：一般采用30min为最适时间，具有良好的特异性和重复性。也有采用60min。时间过长，会造成红血球的形态不整，反应结果紊乱等。
⑹血球浓度：一般为1％，范围为0.5％～1.5％。
（五）操作方法
可采用试管法、凹窝板法和微量法。前者稀释度准确、结果清晰、终点明确。后者具有节约材料、操作方便、结果出现迅速等优点。
试管法的供试材料用兔血清盐水二倍递减稀释，每管0.50ml，各管加致敏血球0.05ml，充分振荡，混匀后置室温，红血球完全沉下（需数小时）或过夜后判定结果。
每次试验需做下列对照：①血清对照：最高浓度的血清＋鞣酸血球；②鞣酸血球对照：兔血清盐水＋鞣酸血球；③致敏血球对照：兔血清盐水＋致敏血球；④标准阳性血清对照：稀释已知滴度的阳性血清，加致敏血球以检验试验的敏感性是否前后一致。
（六）结果判定
＋＋＋＋：管底呈细密的颗粒凝集，边缘不整齐。
＋＋＋ ：全管底呈光滑的均匀片层，边缘折叠。
＋＋ ：全管底呈光滑的均匀片层，如伞状。
＋ ：管底大部分复以光滑片层，边缘稍厚。
± ：较“＋”面积更小，中央有沉积的红血球。
— ：红血球沉积在管底中央，如小圆盘或钮扣状。
以“＋＋”为滴度终点。
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