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 醋酸纤维膜电泳
[ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2006-10-31|  字体: [ ]  

醋酸纤维膜电泳是一项简便而又迅速的方法。它的优点是:①电泳区带分离清楚,比琼脂平板电泳分辨率高;②可以定量;③样品用量少,只需要几微升即可。

(一)材料与试剂
1.pH8.6离子强度0.05巴比妥缓冲液
2.0.5%氨基黑染色液
3.透明液:
冰醋酸                       3 份
95%乙醇                     2 份
混合即可
    4.醋酸纤维膜

(二)操作方法
1.将醋酸纤维膜条浸于巴比妥缓冲液中,浸透后用竹镊子夹到滤纸上,吸去过多的水分。将膜的光滑面向下搭在电泳槽两侧的滤纸桥上,注意搭平。
2.加样  用微量加样器于负极端1.5cm处加样1µl~3µl,注意样品要成一条直线且垂直方向。也可用血球计数板盖玻片蘸取样品轻轻点上。
3.电泳  电压10V/cm~15V/cm或0.4mA/cm~0.6mA/cm电泳45min~60min,至电泳区带展开约2.5cm~3.5cm时,关闭电源。
4.染色  将膜浸于氨基黑染色液中,染色数分钟。
5.透明  将染色的醋酸纤维膜浸于透明液中,漂洗5min ~10min,至背景呈乳白色为止。为了防止膜上出现许多气泡,可以逐渐升高透明液浓度10%、20%以至30%。
6.结果观察及保存  透明后,将膜贴于玻璃上,干后取下,即可观察结果并保存。
7.定量  将各区带剪下,分别浸于4Mol/L NaOH 4ml中,振摇数次,约2h,色泽被浸出,于580nm~620nm比色,测出各区带的OD值。同时剪一块大小相似无蛋白的透明膜同样处理,做为对照。
计算各区带蛋白含量百分比(以血清为例)
总OD值T=A+α12+β+γ
白蛋白%=A/T×100%
以此类推。

(三)注意事项
1.醋酸纤维膜孔隙小,含水量少,且较薄,因此它对热很敏感,故应注意控制电压、电流。
2.样品不可过多,只需几微升即可。
3.加样一定要呈直线、垂直、分布均匀,这样泳动的区带整齐、不歪。
4.注意醋酸纤维膜的质量,浸泡很久仍有大块白色硬点者可弃之不用。

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