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| 夹心法ELISA检测人α2a,α2b干扰素(α2a,α2b)
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| 发布时间：2006-11-01|
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重组人α2a/α2b干扰素(rHuIFN-α2a、rHuIFN-α2b)生产流程中不可缺少的一环是产品的质量监控，通常采用的是HEp-2/VSV或Wish/VSV系统检测干扰素的生物活性。此系统常由于VSV或细胞的影响而不够稳定，且检测周期较长。我们用自制的2种针对rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b的单克隆抗体(McAb)建立了定量检测rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b的双McAb夹心ELISA，敏感性达60pg/ml，结果与生物学活性检测相对应。试用于rHuIFN-α2a生产中的质量控制取得了满意的结果。此试剂盒也能检测人体产生的天然α干扰素，有用于基础和临床疾病研究的潜力。
一、原理：选用2种针对rHuIFN-α2a和rHuIFN-α2b分子不同表位的McAb，1种McAb作为包被抗体，另1种McAb标记辣根过氧化物酶(HRP)作为结合物，催化底物显色。根据标准品OD值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待检标本的含量。
二、试剂盒提供试剂(供检测22份标本)
1. 包被抗体：应用时用0.05M,pH9..6碳酸盐缓冲液作100倍稀释。
2. 酶标抗体：应用时用0.1％BSA-PBS作200倍稀释(售出前已稀释10倍)。
3. 标准品：rHuIFN-α2a(3ng/ml)，用时用0.1％BSA-PBS作倍比稀释。
4. ABTS底物：ABTS 1mg＋0.1M,pH5.0柠檬酸缓冲液 2ml+3％ H２O２4μl(临用时配)。
三、自备试剂和材料
1. 进口96孔或国产40孔聚苯乙烯ELISA板(敏感性以进口板稍好)。
2. 0.1M,pH7.4 PBS配其它液体用。
3. 包被缓冲液：0.05M,pH9.6 Na２CO３-NaHCO３缓冲液。
4. 洗涤液：0.05％Tween 20-PBS。
5. 结合物稀释液：0.1％BSA-PBS(用于稀释标本、标准品和结合物)。
6. 底物缓冲液：0.1M,pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
7. ELISA读数仪等。
四、操作步骤
向ELISA板中加入稀释好的包被抗体100μl/孔
↓ 4℃ 24～48h
洗3次，加入10倍连续稀释的待测标本
(做4个稀释度即可)或倍比稀释的标准品(6个稀释度) 100μl/孔
↓37℃,1h
洗3次，加入稀释好的酶标抗体100μl/孔
↓37℃,45min
洗4次，加入配好的ABTS底物液 100μl/孔
↓RT,30min
测410nm OD
↓
绘标准曲线
五、注意事项：
1. 待检标本必须无污染，无溶血。
2. 标本稀释后加入ELISA板时，注意从低浓度向高浓度依次加入。
3. 结合物稀释液和底物缓冲液中禁止加入叠氮钠。
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