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[ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2006-11-01|  字体: [ ]  

2. MTT法
  MTT(3-(4,5-dimcthylthioazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide , 四甲基偶氮唑盐)可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时,线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲 (Formazan),将结晶的甲 溶解释放,可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性,从而推知待检样品中IL-2的水平。在掌握良好的实验条件下,MTT法的敏感性可接近3H-TdR同位素掺入法。
        IL-2依赖的CTLL用10%FCS RPMI1640洗涤2次,
        每次1000rpm, 5min, 除去原培养液中的IL-2
                  ↓
           调整活细胞数1~2×105/ml
                  ↓
          96孔平底培养板中每孔加100μl
          CTLL悬液(1~2×104/孔)
                  ↓
        加入不同稀释度标准IL-2和待检样品,100μl/孔,
               每份设3个重复孔
                  ↓
            CO?孵箱培养18~24h
                  ↓
           每孔加10μl MTT(5mg/ml溶于PBS)
                  ↓ 4h,37℃
        轻轻吸出150μl上清,加入150μl二甲亚砜(DMSO)
        或酸性异丙醇(异丙醇溶于0.04N HCl)
                  ↓
        溶解10min,测OD值(570nM)
  (三) 试剂和器材
  1. IL-2依赖的CTLL
  2. 10%FCS RPMI1640
  3. 3H-TdR
  4. 标准IL-2
  5. MTT, 酸性异丙醇,二甲亚砜(DMSO)
  6. PPO,POPOP,二甲苯
  7. 9999型玻璃纤维滤纸
  8. 96孔平底培养板
  9. 细胞收集仪
  10. CO?孵箱
  11. β液闪计数仪
  (四)注意事项
  1. CTLL细胞洗涤要充分,但操作必须轻柔,离心速度不宜过高,否则影响细胞的增殖。
  2. 避免同位素污染。
  3. 加标准IL-2或待测样品时,按从低浓度到高浓度顺序加。
  4. 加入3H-TdR最适时机是阴性对照细胞开始全部死亡。
  5. CTLL细胞冻存后复苏较困难,用含有丝分裂原条件培养基长期培养容易发生变异。

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