|
2. MTT法 MTT(3-(4,5-dimcthylthioazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide , 四甲基偶氮唑盐)可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时,线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲 (Formazan),将结晶的甲 溶解释放,可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性,从而推知待检样品中IL-2的水平。在掌握良好的实验条件下,MTT法的敏感性可接近3H-TdR同位素掺入法。 IL-2依赖的CTLL用10%FCS RPMI1640洗涤2次, 每次1000rpm, 5min, 除去原培养液中的IL-2 ↓ 调整活细胞数1~2×105/ml ↓ 96孔平底培养板中每孔加100μl CTLL悬液(1~2×104/孔) ↓ 加入不同稀释度标准IL-2和待检样品,100μl/孔, 每份设3个重复孔 ↓ CO?孵箱培养18~24h ↓ 每孔加10μl MTT(5mg/ml溶于PBS) ↓ 4h,37℃ 轻轻吸出150μl上清,加入150μl二甲亚砜(DMSO) 或酸性异丙醇(异丙醇溶于0.04N HCl) ↓ 溶解10min,测OD值(570nM) (三) 试剂和器材 1. IL-2依赖的CTLL 2. 10%FCS RPMI1640 3. 3H-TdR 4. 标准IL-2 5. MTT, 酸性异丙醇,二甲亚砜(DMSO) 6. PPO,POPOP,二甲苯 7. 9999型玻璃纤维滤纸 8. 96孔平底培养板 9. 细胞收集仪 10. CO?孵箱 11. β液闪计数仪 (四)注意事项 1. CTLL细胞洗涤要充分,但操作必须轻柔,离心速度不宜过高,否则影响细胞的增殖。 2. 避免同位素污染。 3. 加标准IL-2或待测样品时,按从低浓度到高浓度顺序加。 4. 加入3H-TdR最适时机是阴性对照细胞开始全部死亡。 5. CTLL细胞冻存后复苏较困难,用含有丝分裂原条件培养基长期培养容易发生变异。
共2页: 上一页 [1] 2 下一页
上一篇:应用EL-4 CTLL检测IL-1生物学活性 下一篇:白细胞介素6(IL-6)生物学活性检测
|