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| Sepharose CL-4B亲和柱层析纯化IgG及IgG亚类
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| 发布时间：2006-11-01|
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(一) 原理
葡萄球菌A蛋白(SPA)具有与多种哺乳动物IgG分子Fc段结合的能力，并与不同IgG亚类的结合力有所差别。利用改变PH及离子强度可洗脱结合于SPA-Sepharose CL-4B柱上的IgG或不同的IgG亚类，可直接纯化血清或小鼠腹水中的IgG抗体。
(二) 操作步骤
用0.1M PH8.0 磷酸缓冲液浸泡SPA-Sepharose CL-4B凝胶，15min。按1g干胶200ml
上述缓冲液充分洗涤凝胶(用玻璃漏斗过滤或置烧杯中洗涤)
↓
装柱后用0.1M PH8.0磷酸缓冲液平衡
↓
标本可用硫酸铵粗提物，先10,000g离心除去杂质，必要时用0.22μm滤膜过滤。
上样前用1M PH9.0 Tris液调整标本液PH至8.1或对平衡液透析过夜
↓
加样，一般按25～30mgIgG／g湿胶比例加样，室温作用15min,0.1M PH8.0磷酸缓冲
液充分淋洗至淋洗液OD值为〈0.02。
↓
用不同PH的枸椽酸洗脱液洗脱，流速20ml／h。如纯化小鼠IgG1一般用PH6.0；纯化
IgG2a用PH4.0；纯化IgG2b用0.1M PH3.0醋酸盐缓冲液或0.1M PH3.0 Glycine-HCl
缓冲液洗脱。
↓
用PH3.0或4.0洗脱液洗脱时，用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液
↓
收集洗脱液测OD值，根据实验需要透析除盐后进行浓度、纯度和活性测定
(三) 试剂器材
1. SPA-Sepharose CL-4B(pharmacia)
2. 磷酸缓冲液0.1M PH8.0＋0.02％ NaN３
3. 枸椽酸缓冲液 0.1M PH6.0 ┐
0.1M PH4.0 ├＋0.02％ NaN3
0.1M PH3.0 ┘
4. 1M PH9.0 Tris溶液
5. 再生缓冲液(1) 0.1M Tris含0.5M NaCl调正PH至8.5＋0.02％NaN3；(2) 0.1M
醋酸钠含0.5M NaCl调正PH至4.5＋0.02％NaN3。
6. 1～10ml柱体积的玻璃柱或塑料柱
(四) 注意事项
1. SPA-Sepharose CL-4B凝胶价格昂贵，可再生后反复使用10～20次左右。方法:先用10倍柱体积0.1M PH8.5 Tris含0.5M NaCl溶液洗脱柱上的残存杂蛋白；再用10倍柱体积0.1M PH4.5醋酸钠缓冲液含0.5M NaCl液洗脱柱上残存的杂蛋白；0.1M PH8.0磷酸缓冲液平衡，4℃贮存。
2. SPA-Sepharose CL-4B亲和层析法还可用于:(1)除去抗体液中IgG，检测非IgG抗体(如IgM)的生物学活性；(2)除去木瓜蛋白酶或胃蛋白酶水解IgG后的Fc段； (3)回收或纯化免疫复合物。
3. 、狗、猫的多克隆IgM和IgA以及单克隆IgA和IgM也具有与SPA结合的能力。
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DEAE-Sephadex A-50柱层析