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| [ 文章来源： | 文章作者：
| 发布时间：2006-12-31|
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医学基础免疫学实验指导,主编 金伯泉 李恩善,第1版.北京:世界图书出版社,1990
撰稿 金伯泉
从小鼠腹水中纯化McAb的方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析等。应用
TSK DEAE-SPW离子交换层析柱从小鼠腹水中纯化McAb不仅纯化速度快，回收率和得率
高，而且保持良好的生物学活性。
(一) 原理
根据离子交换原理，将经硫酸铵粗提的含McAbγ球蛋白上样结合于层析柱上，通过增
加洗脱液中的离子强度，洗脱并收集蛋白峰。
(二)操作步骤
腹水10,000g离心10min，除去细胞和杂质，在4℃条件下逐滴加入饱和硫酸铵溶液，
使终浓度为40％饱和硫酸铵
↓搅拌20～30min
离心，沉淀用40％饱和硫酸铵洗涤2次后溶于PBS，对缓冲液A(PH8.5 20mM Tris缓
冲液)透析除盐
↓4℃过夜
用带有1000μl样品环的高压加样活门将透析后粗提物加样于经缓冲液A液平衡的
TSK DEAE SPW离子交换层析柱
↓
洗脱流速1ml／min
0～1min：0→5％缓冲液B(20mM Tris, PH8.5, 含2.0M醋酸钠)
1～20min(线性梯度洗脱)：5→20％缓冲液B
高效液相色谱纯化小鼠腹水中单克隆抗体
20～22min：20→0％缓冲液B
↓
洗脱液用紫外280nm进行监测
↓
收集蛋白峰，进行含量、纯度和活性测定
(三) 试剂和器材
1. TSK DEAE SPW离子交换层析柱(75×7.5mm, Bio Rad)
2. 高效液相色谱仪(包括控制系统、溶剂传递系统、高压加压活门和紫外280nm监测
系统)。
3. PBS，缓冲液A和B
(四) 注意事项
1. 所用缓冲液和加样粗提物均需0.22μm滤膜过滤。
2. 在本实验条件下，IgG1峰一般在线性梯度洗脱开始11～12min。但不同类和亚类抗体以及不同特异性McAb的存留时间(retention time)有所差异。
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Sepharose CL-4B亲和柱层