方法二　检测未知抗体的BA-ELISA程序:
　　　包被抗原：用0.05M PH9.6 碳酸盐缓冲液将已知的抗原作适当稀释，
　　　于聚苯乙烯酶标板的孔中加0.1ml，4℃18-24小时。用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
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　　　加样：加适当稀释的待检样品（未知抗体）于反应孔中，同时作空白、
　　　阴性和阳性对照孔。37℃孵育1小时，洗涤。
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　　　加B-Ab2：加稀释过的生物素化抗抗体(抗人或鼠等的IgG)，每孔
　　　0.1ml, 37℃30-60分钟，洗涤。
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　　　余下步骤同测未知抗原的BA-ELISA。
　　(三)　试剂器材
　　1.生物素化抗体：可根据需要从生物制品所购买，也可以自制。本室制备生物素化抗体的程序是：用0.1M NaHCO３溶液将纯化的抗体稀释为1mg／ml，将生物素酰-N羟基丁二酰亚胺酯(BNHS，国内有售)用二甲基甲酰胺溶解，浓度20mg／ml，在1ml抗体溶液中加BNHS液20μl，混匀后置室温(22℃)反应2小时，然后在4℃中对PBS透析24小时，滴定工作浓度后即可使用。
　　2.　酶标记的亲和素：一般生物制品研究所均有销售，可按其说明书进行稀释及使用。如果自行制备，可采用Wilson的过碘酸钠标记法，详见酶标记抗体部分。
　　3.　抗原、抗体和参考血清等。
　　4.　其它的试剂和器材可参考ELISA部分。
　　(四)　注意事项
　　1.　反应物的浓度及比例：由于本法敏感性很高，牥|括所用抗原或抗体均较ELISA法为少，对生物素标记的抗体(或第二抗体)的浓度更应严格掌握，增加抗体浓度可使敏感性提高，但过大又可使非特异性随之增大。
　　2.　生物素的稳定性：生物素标记上抗体的结合物，其稳定性均比酶标记抗体为好，宜长期保存，加入等量60％甘油于-20℃可保存2年左右。保存时切忌反复冻融，反复冻融会使制剂的活性受到损害。
　　3.　亲和素的稳定性：亲和素在一般条件下稳定，对热及多种蛋白质能耐受，但在某些金属离子存在下对光敏感，容易失活。所以在配制亲和素溶液时宜采用无离子水，在4℃置2个月或在-30℃置放半年，反复冻融其活性仍保持不变。
　　4.　亲和素的非特异性吸附：亲和素在PH中性环境中是带正电荷的，可通过静电作用非特异性地吸附到固相载体上，这是引起试验非特异性显色的主要原因。如果增加亲和素稀释液的PH和离子强度，均可明显减少亲和素的非特异性吸附，而对特异性显色也影响不大。也可用戊二醛或醋酸酐对亲和素进行化学修饰，使之乙酰化而减少其非特异性吸附。
　　5.　反应物的作用时间及温度：由于亲和素与生物素之间有很高亲和力，故二者标记物反应时间较抗原-抗体反应时间大为缩短。为了减少非特异性吸附，反应时间不宜过长，一般于37℃以20-30分钟为宜。