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ELISA的试剂
[ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2006-11-01|  字体: [ ]  

 小试管作为固相载体也有较大的吸附表面,而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式ELISA的标本量一般为00-200ul,而小试管可根据需要加大反应体积,标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯,最后直接放入分光光度计中比色。
  也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。其优点是表面积极大,反应在悬液中进行,其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA固相载体,反应后用磁铁的吸引进行分离,洗涤方便,试剂盒一般均配以特殊仪器。
1.1.2  包被的方式
  将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。换言之,包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力。这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的,大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力,其联结多发生在Fc段上,抗体结合点暴露于外,因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时,抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露,在这种情况下,直接包被效果不佳,可以采用间接的捕获包被法,即先将针对该抗原的特异抗体作预包被,其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面,其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用,包被在固相上的抗原纯度大大提高,因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法(见2.2.4),试验的特异性、敏感性均由此得以改善,重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少,仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如,在检测抗DNA抗体时,需用DNA作为包被抗原,而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射(例如30W紫外灯,75cm照射12小时),以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质,如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被,也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系
统作间接包被,即用亲和素先包被载体,然后加入生物素化的DNA,这种包被方法均匀、牢固,已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
  脂类物质无法与固相载体结合,可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中,开盖置冰箱过夜或冷风吹干,待酒精挥发后,让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
1.1.3  包被用抗原 
  用于包被固相载体的抗原按其来源不同可分为天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等,须经提取纯化才能作包被用。如HBsAg可以从携带者的血清中提取,一般的细菌和病毒抗原可以从其培养物中提取,蛋白成份抗原可从富含此抗原的材料中提取等(例如AFP从脐带血或胎肝中提取)。重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原,多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成份外,其他杂质少,而且无传染性,但纯化技术难度较大。以大肠杆菌为质粒体的重组抗原如不能充分除大肠杆菌成份,用于ELISA,在反应中可出现假阳性,因不少受检者受大肠杆菌感染而在血清中存在抗大肠杆菌抗体。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。

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