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| 免疫印记技术(Western-blotting technique)
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| [ 文章来源： | 文章作者：
| 发布时间：2007-08-19|
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一、 概 述
原理
Western-blotting印记是将蛋白质经分离后从凝胶转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。
二、 材料和方法
(一) 材料
1． 质粒 pW425t+SO7
2. 宿主菌菌株 E.coli X51，-86℃保存
3. 培养基 LB基本培养基平板
4. SDS-PAGE试剂
(1) 30%丙烯酰胺／甲叉双丙烯酰胺：29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于终体积为100ml的去离子水中，4℃保存。
(2) 1.5Mol/L Tris-HCl pH 8.8：18.15g Tris碱，溶于去离子水中，浓盐酸调pH至8.8，定容至100ml。
(3) 0.5Mol/L Tris-HCl pH 6.8：6g Tris碱，溶于去离子水中，浓盐酸调pH至6.8，定容至100ml。
(4) 5×电泳缓冲液(pH8.3)：Tris碱45g，甘氨酸216g，SDS 15g，溶于终体积为3 000ml的去离子水中，4℃保存。使用时5倍稀释。
(5) 2×上样缓冲液：SDS 500mg，β-巯基乙醇1ml，甘油3ml，溴酚蓝4mg，0.5Mol/L Tris-HCl pH 6.8缓冲液2ml，加去离子水至10ml。
(6) 染色液：甲醇500ml，冰乙酸100ml，考马斯亮蓝2.5g，加水至1000ml。
(7) 脱色液：甲醇250ml，冰乙酸70ml，加水至1000ml。
5．Western印迹试剂
(1) 转移缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris碱5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加水至总量为1 000ml。
(2) 封闭液：含3%BSA的PBS。
(3) 洗涤液：PBST(0.05%Tween-20)。
(4) Tris平衡盐溶液：溶解8.77g NaCl于800ml 10mMol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，用缓冲液补足至1 000ml。
(5) 4-氯-1-萘酚底物溶液：溶解30mg 4-氯-1-萘酚于10ml甲醇中，取2ml加至10ml Tris平衡盐溶液中，加5μl 30% H2O2混合均匀，5-10min内使用。
(7) 氨基黑染色液：0.1%氨基黑，25%已丙醇，10%醋酸。
6.其它试剂及配制
(1) 10mMol/L萘啶酮酸钠：取250mg萘啶酮酸钠，溶解于终体积为10ml的去离子水中，滤过除菌，小量分装，-20℃保存。
1Mol/L IPTG：取1g IPTG溶于3ml去离子水中，加水至4.2ml。滤过除菌，小量分装，-20℃保存。
（二） 方法
1.对数生长期E.coli X51的制备
(1)冻干菌株的复苏及保存:同E.coli TG1。
(2)对数生长期细菌制备:即挑取基本培养基平板上单个菌落至5ml LB培养基中，37℃、250rpm振摇培养过夜。取100μl过夜培养物接种10ml LB培养基，37℃、250rpm振摇培养至A600为0.3。
2.重组质粒的制备 挑取-80℃冻存的鉴定为阳性克隆。
3. SO7基因的可溶性表达 挑取LB上单个菌落至5ml新鲜制备的LB中，30℃、250rpm振摇培养过夜。
4.表达产物的检测
(1)SDS-PAGE检测：① 12%分离胶配制：双蒸水3.35ml，1.5MOL/L Tris-HCl (pH8.8)2.5ml，10%SDS 0.1ml，30%丙烯酰胺4.0ml，10%过硫酸胺50μl，TEMED 5μl；②4%浓缩胶配制：双蒸水1.22ml，0.5MOL/L Tris-HCl (pH6.8)0.5ml，10%SDS 20μl，30%丙烯酰胺0.26ml，10%过硫酸胺10μl，TEMED 2μl；③待胶凝固后，取下梳子；④样品加等量上样缓冲液混匀，100℃煮沸2min，12000rpm离心5min，上样后稳压条件下电泳，浓缩胶100V、分离胶150V，至溴酚蓝迁移到凝胶底部时，停止电泳；⑤取出凝胶染色2-3小时后脱色，观察蛋白带。
（2）Western-blotting检测：①SDS-PAGE结束后，取出凝胶，将在转移缓冲液中浸泡约30min与凝胶同样大小的Hybond膜和3mm滤纸按海绵垫-滤纸-凝胶-Hybond膜-滤纸-海绵垫的结构，装入转印夹中，各层间不能有气泡。转印时凝胶侧接负极，Hybond膜侧接正极，转印电泳槽置冰浴中，200mA恒流转印1小时；②转印结束后，按加样孔的位置，剪下分子量标准的膜条用氨基黑染色，观察转印效果。其余部分置于封闭液中室温振摇1小时；③取出后置于用封闭液稀释为1：1000的HRP/兔抗鸡IgG-HRP结合物中，室温振摇1小时；④取出膜用洗涤液洗6次、蒸馏水1次、双蒸水1次，每次30秒；⑤最后将膜浸入至底物溶液中直至适中的颜色出现；⑥用蒸馏水、双蒸水冲洗终止反应。
三、结果判定
SO7基因表达产物为26KD，所以在蛋白Marker 显示的26KD处应有一条目的带。但如果所用的抗血清不纯，就有可能在还有其它非特异性条带出现，这可能是菌体蛋白与血清中抗体结合的原因。
在本实验所作的Western-blotting分析中显示，除了所需的与SO7表达蛋白相配的特异性杂交条带以外，还出现了非特异性的两条带，这可能是实验中所用的抗球虫血清中含有抗大肠杆菌的抗体，因为在鸡体内还存在着或感染了大肠杆菌的可能性，其中大肠杆菌的部分抗体可能与工程菌的菌体蛋白相同，故而出现了非特异性条带。
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流感病毒分离标准操作规程