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| [ 文章来源： | 文章作者：
| 发布时间：2007-01-21|
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原位杂交组织制备
1．切取的组织PBS洗涤。
2．4%多聚甲醛/0,1M磷酸盐缓冲液pH7.4在4℃固定组织1-3hrs。避免固定过夜，如果固定过长可能引起组织附着在载玻片上的问题。
3．组织浸入无菌15%蔗糖/1×PBS中3hrs。到4℃过夜。
4．用OCT包埋。
5．组织块冷冻在液氮中，把组织包埋块的1/3（大约）放入液氮中直到包埋剂OCT的中心完全冻结，包埋块上出现干冰。
6．组织放入密闭容器中或用锡箔包住贮存于—70℃。
如果不能用多聚甲醛/蔗糖法，还可以采用冷冻新鲜组织用于原位杂交。组织也要用PBS洗涤，OCT冷冻包埋组织块。上述方法虽然不够理想但没有模型也能速冻组织。固定剂蔗糖和OCT步骤的应用主要是为了改善组织形态。上述固定时间不能完全彻底固定大块组织，然而在原位杂交步骤开始时有附加固定步骤确保杂交前组织充分固定。
此方法用于大（1 cubic cm）和小（到1 cubic mm）组织样品是成功的。
4%多聚甲醛
混合于2000ml烧瓶中：
200ml 0.5M 磷酸钠（NaPO4）pH7.4
800mldepcH2O
将液体加热到70℃加入40g多聚甲醛（EM grade, Polysciences, Cat No. 0380）加热4-5min液体会变清亮，过滤后及时装入1000ml瓶中，迅速用冰 冷却液体防止多聚甲醛分解。4℃可保存两周。
15%蔗糖PBS配
500ml 灭菌PBS
75g无RN酶（RNase free）蔗糖
试剂混合后用一次性小型Nalgen 过滤器（0.45 micron）除菌。4℃保存。
标本的贮存与制备
标本：
1．冰冻切片裱贴于胶包被的载玻片上。
2．细胞涂片和细胞离心自动涂片（见Cytospin的制片步骤）。
3．固定剂-固定（福尔马林，Bouins或B5）石蜡切片裱贴于胶包被的载玻片上。
冰冻切片/涂片/细胞离心自动涂片
冰冻切片/涂片/细胞离心自动涂片采集较好，没有必要用胶包被的载玻片（Fisher, superfrost plus cat 12-550-15）在48小时内按如下处理。
1．在凉爽干燥的地方空气干燥1小时或48小时。
2．室温下纯丙酮固定10min。
3．彻底干燥15min。
4．室温贮存于凉爽的地方（不进冰箱，也不要冻存）从制片开始算起总共需要48小时。
5．冷冻。
原位杂交标本的处理
注意：RNA酶存在时很不稳定。RNA酶是无所不在的，皮肤上，物体的表面。要是用干净的没有处及的玻璃器皿，尤其是试剂保存瓶，DPC-处理水溶液和70%酒精可灭活此酶。
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