显微放射自显影就是运用放射性标记化合物掺入生物样品，以及用核乳胶记录生物样品内放射性同位素释放核射线的技术。根据放射性标记化合物的性质和银粒的分布部位与数量可显示生物样品内生物大分子合成的特异性、部位、相对数量及其动态变化。因此放射性自显影技术广泛应用于生物大分子新陈代谢的研究工作。

一、目的与要求

1、了解放射自显影的原理与用途。

2、初步掌握显微放射自显影样品的制备和方法

3、基本学会显微放射自显影样品的观察、记录与分析

4、验证细胞核内DNA与RNA合成的标记

二、原理

同位素在机体内（或细胞）具有相同的代谢途径；掺入生物样品内放射性同位素释放的核射线产生电离作用，使乳胶中的一些银离子发生聚集而形成“影像”；显影后“影像”处的银离子还原呈银原子，定影期间，乳胶内未聚集的银离子被溶解至定影液中，因此生物样品内掺入放射性同位素的部位呈黑色颗粒，简称银粒。并且放射性标记化合物的掺入量、生物样品中核蜕变释放的射线量和银粒数三者之间成正比。

三、实验内容

1、³H－T标记组培细胞DNA的合成。

2、³H－U标记四膜虫RNA的合成。

四、实验步骤

（一）组培细胞DNA合成的显微放射自显影技术

1．  制备放射性³H－T标记的生物样品

（1）       培养细胞：在每个洗净的青霉素瓶中放入一块长方形的盖玻片，加入1ml细胞悬液，置37°C培养细胞。

（2）       标记：当盖玻片50－70％的表面长有细胞时，将实验组的盖玻片转入装有1ml含³H－胸腺嘧啶核苷（³H－T的剂量未1mCi/ml）培养液的青霉素小瓶内。对照组倒掉原培养液后，加入1ml不含³H－T的新培养液。将两组细胞置于37°C恒温箱内继续培养30分钟。

（3）       洗涤：从青霉素小瓶中取出长有细胞的盖玻片，放在冷却的Hank液内洗涤5－8分钟（中间换Hank’s液2次），以洗去玻片及细胞表面吸附的 ³H－T。

（4）       固定：将盖玻片放入Carnoy固定液中固定30分钟（中间换液1次）。

（5）       洗涤：在95％、75％的酒精中洗2次，每次3分钟。然后将小玻片放在滤纸上干燥。

（6）       贴片：在干净载玻片的中间偏右处滴上一、二滴中性树胶，将小玻片在无细胞的一面贴附在载片上，置37°C温箱干燥两天。

（7）       编号：在载片近端处贴一小条胶布，根据实验分组，用铅笔在胶布上统一编号。

（8）       涂保护膜：将两张载玻片无细胞的面紧贴在一起，将有细胞的载玻片一端浸入37°C预温的0.5％的明胶液中，缓慢取出，分开两张载片，竖放于切片盒中。或在小玻片旁滴明胶液，用玻璃推子涂保护膜，置37°C干燥。

上述放射性同位素实验操作步骤，应在指定的实验桌上具有放射性防护设施的托盘内进行。

2．  制备乳胶膜

这一过程全部在暗室安全红灯下进行。

（1）融化与稀释乳胶：先在一个刻度离心管内加入1－2ml蒸馏水，然后在暗室安全红灯下加入等量的核IV乳胶，供滴胶制膜法用；或在有机玻璃盒内加3－5ml蒸馏水与等量的核IV乳胶，供浸胶制膜法用。再将盛乳胶的离心管或有机玻璃盒置40°C水浴中保温15分钟，使乳胶融化。中间可用细玻棒或细玻管搅动乳胶两次，使其充分混匀，但切勿产生气泡。

（2）滴胶制膜法：将载玻片置水浴右边的金属板上预热3分钟，用细玻璃棒吸取融化的乳胶，向样品旁的载玻片上滴一滴乳液，用玻璃推子牵引乳胶，使之均匀地覆盖在标本及载玻片上，然后把载玻片平放在水浴左边的金属板上，待数分钟，使乳胶分布均匀，并在暗室内干燥。

（3）浸胶制膜法：将两张载玻片无细胞的面紧贴在一起，将有细胞的一端浸入乳胶内（样品部分的载玻片务必完全浸在乳胶内）缓慢取出，分开两张载玻片，竖放在切片盒内，于暗室内干燥（图4）。

（4）包装：待乳液干燥后，将载玻片放入切片盒内，在盒的一端放一小袋干燥的硅胶（吸水剂），盖好切片盒，盒外用黑纸包裹，写明盒内样品的组别，以及涂胶日期等。

3．  自显影“影像”的形成与显现

（1）“曝光”：将上面包装好的切片盒置4°C的冰箱内存放5－7天。放射性同位素核蜕变时放出的射线对乳胶的电离作用形象地比喻为“曝光”。

（2）显影：在暗室安全红灯下，将曝光的自显影片放入18－20°C的显影液中5－8分钟，其间搅动显影液数次。从显影液中取出自显影片，立即放入停影液中漂洗30秒钟。

（3）定影：将自显影片转移到18－20°C的定影液内定影15分钟，其间搅动定影液数次。将自显影片转入自来水中冲洗30－60分钟，再用蒸馏水浸洗1分钟，然后放在制片屉上干燥。

（4）染色：向自显影样品上加几滴Giemsa染色液，使其覆盖全部样品，染色10－15分钟，然后用蒸馏水洗净染液。

（5）脱水：将自显影片放在37°C下干燥2－3天，或在浓度递增的酒精中脱水。

（6）透明：自显影片经过两个二甲苯染色缸，共透明15分钟。

（7）封片：从二甲苯中取出自显影片，立即擦去多余的二甲苯，将自显影片平放于制片屉上，在样品上加中性树胶，轻轻地盖上盖玻片，注意勿产生气泡。自然干燥后，就制成了显微自显影样品（图5）。

4．  ³H－T标记细胞DNA样品的观察和记录

（1）       观察：先在中倍镜下观察显微自显影样品的全貌，检查样品各部分的标记状况，有无假象，以及标记细胞的数量。然后在高被镜下观察标记细胞中银颗粒的分布部位与数量。应在细胞核中看到银颗粒，而核仁处几乎无银颗粒。

随机取样品上、下、左、中、右五个视野，计算五个视野中的标记细胞数及细胞总数。或随机水平移动样品，数500－1000个细胞，并计算其中的标记细胞数。按下式计算标记细胞的百分数（或称标记指数）：

标记指数＝标记细胞数/细胞总数´100％

（2）       记录：画出标记细胞与未标记细胞的图。并写明细胞种类，放射性标记化合物的名称、标记液的放射性强度，标记时间，核乳胶名称，曝光时间，显影液名称及显影时间，染液名称等实验条件。

（二）³H－U标记四膜虫RNA的合成

1．              制备³H－U标记四膜虫样品

（1）取培养18－24小时的四膜虫悬液1ml，转移至离心管内。

（2）标记：加入0.1ml³H－U（10mCi/ml），混匀，20－25培养四膜虫10分钟。以1000转/分的转速离心2分钟，把上清液转移至1号废液瓶内。

（3）洗涤：加入1ml蒸馏水，混匀细胞，洗涤5分钟。以1000转/分的转速离心2分钟，将上清液转移至2号废液瓶内。如上再洗涤1－2次。上清液转移至2号废液瓶内。

（4）固定：摇动离心管，悬浮细胞。加入0.5ml，10％福尔马林固定液，固定细胞5分钟，再加入0.5ml固定液，继续固定5分钟，离心后将上清液转入2号废液瓶内。

（5）洗涤：加入1ml蒸馏水，悬浮细胞，洗涤5分钟，离心后再洗涤1次，上清夜转移至2号废料瓶内。

（6）制备细胞悬液：悬浮细胞后加入0.3ml 75%宜春，混匀细胞。

（7）涂片：向载片中央滴加1滴细胞悬液，转动载片，使细胞混匀、散开。

（8）编号：在载片近端处贴一小条胶布，用铅笔编号。

涂明胶保护膜以及制备乳胶膜等操作步骤同组培细胞部分。

五、习题

1、³H-T标记组培细胞时，为什么有的细胞内有银颗粒，有的细胞内没有银颗粒？为什么有的细胞内银颗粒较多，有的细胞内银颗粒较少？ 核仁处有无银颗粒，为什么？

六、有关放射自显影的基本知识

（一）   放射性同位素与电离射线

在自然界中，很多元素的原子序数相同，即核内质子数与外层电子数相同，而中子数量不同，这些元素成为同位素。

同位素具有相同的化学性质，但原子量不同。每种同位素只有在中子数与质子数达到一定比例时，原子核才是稳定的，这种同位素称为稳定同位素。当这种正常的比例遭到破坏时，原子核就会发生蜕变，放出射线，这种能放出射线的同位素称为放射性同位素。如氢元素就有三种同位素：占天然氢99.9488%的¹H（氢），核内只有一个质子；另一种²H（重氢或氘）核内有一个质子和一个中子；而在自然界中极为稀少的3H（氚），它的核则是由一个质子和二个中子组成。所以¹H、²H和³H的质子数相同而中子数不同（或者说原子序数相同而原子量不同）。它们在元素周期表中占有相同的位置，原子序数都为1，因此称它们为同位素。¹H和²H是稳定性同位素，³H是不稳定的，它能放出β粒子而蜕变为氦，所以³H为放射性同位素。

放射性同位素的原子核是很不稳定的，能自发的蜕变并放出射线，不同的放射性同位素在蜕变过程中放出的射线也不相同，分为α、β、γ三种射线。α射线的本质为氦核，带正电荷。β射线的本质为电子。γ射线的本质为光子流即电磁波。这三种射线在性质、质量、射程、穿透能力、能量、半衰期等方面差异很大（见表1）。一般在放射自显影技术中只能使用发射α与β粒子的同位素。

从表1可知α粒子是带有正电荷的氦核，具有较大的质量和中等的能量，速度慢，射程短，它穿透物质时的径迹呈直线。由于α粒子带有正电荷，它和相碰的原子和分子起着相互的静电作用。α粒子能从原子和分子中打出电子，而使α粒子通过的介质发生电离作用。一个α（或β、γ）粒子在介质中所产生的离子对叫电离比度，在单位射程中所产生的离子对叫电离密度。

β粒子质量小而轻，电离比度比α粒子小，但相对能量较大，所以射程、穿透力和速度比α粒子大，在乳胶内的行程为自由折射式，在距离射源较远的地方也能使乳胶感光，并且形成的颗粒较多，但一般黑度较浅而不集中，所得的影像比α粒子的清楚。β粒子的能量大小因放射性同位素而异，能量愈小则形成的影像愈清楚，因为能量大，射程远，射线分散而不易在乳胶中显现出明显的影像或径迹。³H放出的β射线能量小，其射程短，往往只形成1-2个银颗粒，而不能形成连续的粒线状径迹，所以影像清楚。

表1 射线的物理特性

γ射线能量大，又不带电荷，质量几乎为零，所以它的速度大，射程长，电离密度很小，γ射线一般不用于放射自显术。

（二）   生物学研究中常用的放射性同位素及放射性标记化合物

1、常用于自显影术中的放射性同位素及其性质

放射性同位素的射线都能对感光材料发生作用。但只有α和β粒子适用于放射自显影，其中主要的还是β粒子同位素。但是在具有生物学重要意义的元素中，没有一种α粒子的发射体。在生物大分子的主要组成元素中，毫无例外的都具有放射β粒子的同位素。例如³H，¹⁴C，³⁵S，³²P等，它们的能量低、射程短、电力能力强，从而可以获得较好的分辨率。它们是研究生物体放射自显影技术的有效工具。因放射性同位素的种类不同，其β粒子在乳胶中的射程差异很大。在显微放射自显影中常用的放射性同位素列于表2中：

表2 常用放射性同位素的基本特点

选择以上放射性同位素来标记生物分子并作为放射自显影研究的元素的原因有两个：

（1）这些放射性同位素均能放出β射线（尤其是中等能量与低能量的β射线），β射线易使乳胶感光而产生清晰的银颗粒，分辨率好，它们在乳胶内射程合适。根据实验的条件和要求，可选择半衰期较为合适的同位素。

（2）这些同位素使细胞生命活动中基本的，起重要作用的元素，它们都是重要生物分子结构的组成成分。它们可以结合（标记）在重要的分子上，作为重要生物大分子的合成的前体掺入机体或细胞。我们即可应用自显影技术追踪这些物质的位置和动态：

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