4. 培养

     分装好的细胞瓶上，做好标志，注明细胞代号、日期。置于细胞架上，轻轻摇动。以使细胞均匀分布，以免细胞堆积成团。然后置于37℃培养。

     5.观察

    （1）观察体外培养细胞的几个问题：

     细胞培养24小时后，即可进行观察，观察的重点如下

     A.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度。

     B.观察培养液颜色变化及细胞是否生长。

     C.如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时，可参照以下（2）的描述进行。

     D.观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死活细胞的比例。

    （2）细胞的生长阶段及形态特征

传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。一般单层培养的细胞，从培养开始，经过生殖、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将其分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：

A．                  游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩和表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数小时。

B．                  吸附期（贴壁）：由于细胞的附壁特性，细胞悬液静置培养一段时间（约7～8h）后，便附着在瓶壁上（此期不同细胞所需时间不同）。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。

C．                  繁殖期：培养12h以后直到72h（不太细胞亦不同），细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛（即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布瓶壁上），到细胞铺满整个瓶壁（即所谓形成细胞单层）的过程。此期细胞形态为多角形（呈现上皮样细胞的特征）。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“＋”的多少表示如下：

＋：细胞占瓶壁有效面积（也就是细胞能生长的瓶壁面积）的25％以内有新生细胞。一般要观察3－5个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。

＋＋：细胞占瓶壁有效面积的25～75％以内具新生细胞。

＋＋＋：细胞占瓶壁有效面积的75～95％具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。

＋＋＋＋细胞占瓶壁95％以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。

从＋＋→＋＋＋＋为细胞的对数增长期（或称为指数增长期），

D．                 维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。

E．                  衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙、细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。

四、习题

1．  简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。

2．  细胞培养获得成功的关键要素是什么？

3．  简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。

附录：细胞培养中的有关问题

（一）细胞的计数方法

细胞计数一般用血球计数板，按白血球计数法进行计数。

操作方法如下：

1．  首先取待稀释的细胞悬液1ml加4ml生理盐水（或Hank液）作5倍稀释。

2．  先将特制的盖玻片放在血球计数板上，使两侧均现带色牛顿环。用血色素吸管（或细胞管）取少量待测细胞悬液，沿盖玻片边缓缓滴入，让其自由渗入，待整个盖玻片下均充满细胞悬液为宜。注意不要使液体流到旁边的凹槽中（图2）

3．  在显微镜下，用10´10的倍数进行计数，所用计数板如图2所示。

4．  计数的方法：按图2计算计数板的四角大方格（每个大方格又分16个小方格）内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个方格中，如果有细胞位于线上，一般计上线细胞不计下线细胞，计左线细胞不计右线细胞，计数误差不能超过±5％。

5．  计数的换算：计完数后，需换算出每毫升悬液中的细胞数。由于计数板中的每体积即为0.0001cm²。故可按下式计算

                  原细胞悬液细胞数/ml＝n/4´10000´5（稀释倍数）

n＝四大格内的细胞总数

（二）影响离体细胞生长繁殖的一些因素

细胞生长、繁殖的最适条件是它们在机体内所处的条件，但如将组织、细胞从机体内取出，让其在离体条件下生存，那就必须模拟机体的环境。然而机体毕竟是太复杂了，所以在体外只能保证细胞生长，繁殖所需要的最基本因素，现简单介绍这些因素的作用。

1．  培养基（液）：细胞培养所用的培养基主要是人工合成的。通常其主要成分含有氨基酸、维生素、糖类、无机盐、生长因子和其他的辅助物质。当然不同的组织和细胞对培养基成分的要求有所不同，因而进行培养时应区别对待，为其选择最适条件的配方。配制时应注意以下几点：

（1）       水是细胞生命活动的重要因素之一，细胞培养用的各种液体都要用水配制。由于有毒物质和元素等即使含量很低也能引起细胞培养的失败，所以细胞中所用的水必须经过高度的纯化。通常使用的是三次蒸馏水或去离子水。

水质的好坏可用电导仪检测其电阻值，即水中离子的导电状况，越低的水含离子越少，电阻值也越高。一般以25°C时的欧姆（W）/cm表示。细胞培养用水的电阻值一般选用100万欧以上的去离子水为宜。

（2）       无机离子既是维护细胞生命所需要的成分，而且对维持一定的渗透压、缓冲和调节溶液的酸碱度等方面都起着重要的作用。所以在配制细胞培养液时，必须根据这几方面的需要，加入必需的一些无机盐类。就多数动物来说，所需的无机盐类有Na^＋，K^＋，Ca^2＋，Mg^2＋，Cl^－，碳酸盐，磷酸盐等。它们彼此之间常保持一定的比例。破坏了这种关系，就会使培养的细胞受到损害。

（3）       血清是细胞培养液中的重要成分之一。血清中含有丰富的营养物质，如蛋白质和核酸等，血清不仅为细胞的生长提供所必需的营养，还具有促生长能力。血清对细胞附着和生长均有明显的促进作用，并能中和有毒物质的毒性，使细胞不受到损伤。用于细胞培养的血清来源是多种的，如人血清、马血清、兔血清等。最常用的是牛血清。一般讲动物愈年轻，其血清愈有利于细胞生长，故成年牛血清不如犊牛的好。细胞培养中所用血清的质量会直接影响到细胞生长的状况。

（4）       pH值对细胞生长有影响。来源不同的细胞，由于它们处于有机体的不同部位或器官，其所处外环境的pH值也不相同，所以在培养细胞时，应参考该细胞在机体内所处外环境的pH值配置适宜pH培养基（液）。一般以中性为好，刚开始培养的哺乳动物的细胞，pH在7.0左右较好，贴壁生长的细胞在pH7.2－7.4生长最好，以不超过pH6.8－7.6为宜。高于或低于此限度时，往往会引起细胞死亡。在细胞培养过程中，必须注意培养液pH值改变与细胞生长的关系，找出规律。在pH值变得不适于细胞生长时，应及时更换新的营养液。

2．  温度：离体培养细胞一般要参考该种动物的体温设计培养时所用温度。通常哺乳动物的体温在37－38.5°C，禽类略高些，温度在39°C－40°C。因此，离体哺乳动物细胞培养的温度最适为37－38.5°C。在较低温度环境中，对细胞影响不大，但细胞对较高温度却比较敏感。

3．  密度：密度是指细胞接种浓度。在细胞培养中，接种的细胞数目对细胞的生长状况有很大的影响。适宜的细胞浓度可以促进细胞的增殖。接种的细胞浓度过大或过小，均对细胞的增殖不利。尤其是原代细胞，其接种量与培养时细胞增殖的关系最大。一般接种的细胞（如肾细胞）数目以30－70万/ml为宜。

4．  器皿的清洗：细胞培养所使用的器皿必须干净，所以在细胞培养工作中，器械的清洗是十分重要的，也是起关键性作用的工作，它直接影响到细胞培养的成败。

（1）       新玻璃器皿的清洗步骤：先用自来水或肥皂水刷洗干净，放入洗液中过夜或浸泡几天，取出用自来水冲洗8至10次。然后，用蒸馏水洗3次，用去离子水（或三蒸馏水）洗2－3次，烤干、包装、灭菌。

（2）       橡皮制品的清洗步骤：一般选用白皮橡皮塞，使用前先用自来水洗涮干净，以后用2％NaOH煮20分钟，用自来水冲洗5－6次，再用1.3％HCl煮30分钟，用自来水冲洗5－6次，用蒸馏水洗3次，最后用去离子水洗，干后包装灭菌。

（三）细胞培养的有关名词及其概念

1．  原代培养（primary culture）

直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。这种培养称之为原代培养。

2．  传代培养（subculture）

细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。

3．  悬浮培养（suspension culture）

细胞培养的一种类型。培养时通过一特殊的装置，使细胞瓶按一定的速度不断地转动，使细胞始终处于悬浮状态中进行增殖。

4．  克隆（clone）

克隆指的是从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（population）。

5．  细胞系（cell line）

在第二届细胞和组织培养专题讨论会上提出细胞系的概念为“原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（lineages of cells）所组成。如果不断继续传代或传代数有限，可称为有限细胞系（finite cell line），如果可以连续传代，则可称为连续细胞系（continous cell line）。以前认为细胞系来自细胞发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限的传下去。这种细胞的特点是染色体为异倍体，丧失了正常细胞的“接触抑制”的特性。

6．  细胞株（cell strain）

细胞株的概念如下：由原代培养中，用选择或克隆代，选出具有特征标记的细胞，经传代形成细胞株，这些特性或标记在以后的培养中必须保持下去。以前认为经体外传代培养后细胞不表现退化现象，大约可传50代以上者，其染色体维持二倍体不变，保留正常细胞的“接触抑制”等特性。