实验指导-动物细胞培养与观察

    细胞培养是将器官、组织或细胞从生物机体中取出，模拟该器官、组织或细胞在机体内的生理条件，在体外进行培养，使其能够继续生存、生长和繁殖。一些研究结果表明，许多种类的动物或植物的细胞都能在人工培养条件下生存、生长和繁殖。

现代的动物细胞培养始于美国动物学R.G.Harrison。他于1906年在无菌条件下，以淋巴液做培养基，培养了蝌蚪的神经板，并观察到神经细胞突起生长的过程。到了20世纪后半叶，随着分子生物学和细胞生物学的崛起，为了在活细胞中研究生命现象，细胞培养方法得到了广泛的发展和应用。

细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响。因为人工培养条件易于改变，并能得到严格的控制，有利于单因子分析。二是细胞培养便于我们对细胞生长、发育过程的观察，可以用显微镜直接观察亦可应用显微缩时电影技术记录其进程。因而，细胞培养是探索和解释细胞生命活动规律的一种简而易行的技术。

然而，细胞培养方法也有其局限性，由于培养的细胞生活在脱离了机体的复杂的环境条件下，其生态环境和细胞之间的相互关系都改变了，因此，其细胞生物学性质必然也会发生某些改变。所以在人工培养条件下观察到的结果难于正确反映细胞或组织在机体内部的状况。这一点是我们在应用此技术进行研究时应该注意的。

尽管如此，由于细胞培养技术的优点是其他实验方法和技术所不能比拟的，所以近年来，细胞培养技术在分子生物学、遗传学、老年学、免疫学、肿瘤学和病毒学等很多领域都得到了广泛的应用，并取得了很多重大的成果。

细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。

一、目的与要求

通过本实验了解原代细胞与传代细胞培养的基本方法以及在细胞培养过程中严格的操作程序。

初步掌握无菌操作的基本原则，认识无菌操作在细胞培养中的重要性。

二、实验内容

1、原代细胞的制作——示范

2、传代细胞的传代

三、实验步骤

（一）原代细胞的制作——以乳鼠肾细胞原代单层静置培养为例，按实验时操作的顺序进行描述。

1.       操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放在合适的位置，然后配置营养液及调节平衡盐液的pH值。

2.       配液

（1）       乳鼠肾细胞营养液的配置：

0．5％LH液                                 90％

犊牛血清                                    10%

1万单位/ml青、链霉素              加至约100单位/ml

7.4%NaHCO₃                      调pH至6.8~7.0

(2)              平衡盐液－Hank液的调节：

用7.4％NaHCO₃调Hank液的pH至6.8~7.0

(3)              调胰蛋白酶的pH值

25%胰蛋白酶溶液中加入数滴NaHCO₃,充分混匀,使其pH值为6.8~7.0。

3                                                       处死动物

     在动物细胞培养中，为避免过多血细胞的干扰，一般采用剪断动物颈动脉放血的方法处死动物，然后用水浸湿体表的被毛（或用新洁尔灭溶液）。将动物固定在解剖板上，使其背部向上，先用碘酒棉球消毒背部的被毛，然后再用酒精棉球擦拭碘酒擦过的部位。

    4   取肾

在腰部的后缘，用解剖剪提起皮肤，剪开皮肤，将剪开的皮肤分别拉向两边。此时，再换一把解剖剪及解剖镊，剪开背部的肌肉，暴露出腹腔，即可见到肾脏（一般右肾略低于左肾），用弯头眼科镊取出肾脏，置于无菌培养皿中。

5   剪肾

用眼科剪及镊，将肾膜剪破，并将其剥向肾门，去肾膜及脂肪。再用Hank液洗涤一次，再将洗过的肾脏转入另一培养皿中。另换一把眼科剪及镊，沿肾脏的纵轴剪开，去掉肾盂部分，将肾剪成数块，然后用Hank液洗涤一次。将洗过的肾块转移入无菌的青霉素瓶（或小烧杯）中。用弯头眼科剪，将肾剪成1立方毫米大小的块，组织块的大小应尽量均匀一致，再用Hank液洗涤2～3次，直到液体澄清为止。

6           消化及分散组织块

将上步清洗过的Hank液吸掉，按组织块体积的5～6倍量加入0.25%胰蛋白酶液(pH为7.6~7.8)。置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20～40分钟左右（消化时间的长短与多种因素有关，如蛋白酶的活性及浓度，不同动物及年龄，组织块的大小等等）。每隔10分钟摇动一次青霉素瓶，以便组织块散开，以利于继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。这时可从水浴中取出青霉素瓶，吸去胰蛋白酶液，再用Hank洗涤2～3次。然后，加入少量乳汉液，用吸管反复吹打组织块，直到大部组织块均匀分散成混淆的细胞悬液为止。此时，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布（或不锈钢网）进行过滤，以除去部分较大的组织碎片。

7   计数与释稀

从上步滤过的细胞悬液中吸取1ml细胞液，进行计数。将细胞滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释，稀释后的浓度一般为每ml含细胞30～50万为宜。

8   分装与培养

     将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般5ml/小方瓶，1ml/青霉素瓶），盖紧瓶塞，注意瓶塞一定要紧。在培养瓶的上面做好标记，以免培养瓶放反，并在瓶口处注明细胞，组别及日期。然后放于培养架上，并轻轻摇动培养架，避免细胞堆积，以便细胞能均匀分布。最后将培养瓶置于37℃条件下进行培养。

    9  观察

     置于37℃培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：

      （1）培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示已经被污染。

      （2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。

      （3）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。

经过1～2天的培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。换液时也要注意无菌操作，在酒精灯旁，倒去原培养液，再加入等体积的新配营养液，pH7.0。若经2～3天后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。如果希望细胞长得更好些，此时也可换液，换液时，所用的营养液称为维持液，它与营养液的组成完全相同，仅所用血清为5％。以后，每隔3～4天（视细胞液pH值而定）更换一次维持液。待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养。

（二）传代细胞的传代

 在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成致密单层，即可进行细胞的传代培养。   

     各种传代细胞的传代方法基本相同，只是各种细胞所需的营养液成分有差别，现以HeLa传代细胞系为例介绍细胞传代的基本方法。

     1.首先配制营养液

             E－EM液                                   90％

             犊牛血清                                          10％

             双抗（1万单位/ml）                约100单位/ml

             3%谷氨酰氨                                 1ml

             7.4%NaHCO₃                      调pH至7.0~7.2

    2.在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液，然后加入适量的无钙，镁离子的PBS液，轻轻摇动，将溶液倒出。

    3.消化与分装

    在上述瓶中加入适量消化液（0.02%EDTA或0.04%EDTA+0.5%胰蛋白酶液各一半）以盖满细胞为宜，置于室温，停留2～3分钟，翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙（针孔大小的空隙），如出现缝隙，即可倒去消化液，如未出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直到出现缝隙为止（消化时间的长短与不同的细胞及生长状态有关）。此时，可倒去消化液，加入新配置的营养液3ml，以中止消化。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液，反复吹打瓶壁上的细胞层，直到瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时，可继续轻轻吹打细胞悬液，以使细胞散开。随之即可补加营养液，细胞传代的比例，不同的细胞亦不同，HeLa细胞一般以1:2或1:4进行分装，即一瓶细胞可分装两瓶。若原瓶为5ml营养液，要分装成两瓶，则需补液到10ml，混匀，即可将另一半分装至另一瓶中。