2. 1. 3　溶氧阶段培养
      不同细胞和同一细胞在不同生长时期对氧的需求均不相同.有人 发现细胞生长的最适溶氧值为60% , 但有人发现杂交瘤的最适溶氧为100%。一般说来, 溶氧主要影响细胞的繁殖, 而对产物的生成无直接影响, 通过影响细胞生长间接起作用。通常在细胞生长初期控制溶氧的较低的水平, 在对数生长期, 当细胞达到较高的浓度时, 提高溶氧水平; 在产物生成期, 应控制溶氧的适当水平。溶氧过高, 细胞就会加速消耗营养物质, 产生许多代谢产物。这些代谢产物对细胞有抑制作用, 会大大降低细胞的存活率, 降低产物的比生成速率。溶氧过低, 细胞过氧的需求得不到满足, 依然会降低产物蛋白的产率。
2. 1. 4　化学试剂诱导阶段培养
    如果构建的细胞上有可诱导基因, 进入产物生成期后, 就可以添加化学试剂对基因进行诱导, 以实现目的基因的高表达, 比如,将表达尿激酶原和二氢叶酸还原酶基因的两个转录单位置于同一载体, 分别受金属硫(M T ) 和SV 40 早期启动子控制, 具有用氨甲喋呤(M TX) 使基因扩增和利用金属Zn2+ 诱导的双重功能, 有利于尿激酶的高表达。
    细胞在细胞周期的不同时期, 不仅蛋白的分泌速率不同, 而且所分泌蛋白的类型和糖基化程度也可能不同。因此, 研究并控制细胞的生理状态很重要。然而, 在细胞培养中, 细胞生理状态的检测很麻烦。有人发现,细胞大小随各时期变化很明显, 因此可以作电子细胞计数器就行了。分段培养应结合具体的培养条件进行。有些细胞的最适生长温度和产物生成温度相同, 就不能进行温度阶段培养, 而应寻找别的差异条件。在细胞生长期有的细胞可能会因比生长速率过大而产生非生产性细胞, 这时就应控制比生长速率在一个适当的范围。
3　代谢调控培养
      乳酸和氨是在培养过程中动物细胞产生的主要代谢产物 , 对细胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。在分批培养和补料分批培养中的这一问题尤为突出。尽管灌注培养可以通过提高灌注速度来去除抑制产物。但是, 一方面由于灌注培养细胞浓度很高, 提高灌注速率, 营养成分的供给十分充分, 氨和乳酸的产生速率也增加了。另一方面, 过高的灌注速率提高了细胞的比生长速率, 降低产物的比产率, 加上细胞对营养的利用并不彻底, 培养液中会残留大量的蛋白, 造成提取纯化的不便和培养基的浪费。所以, 在培养中调控动物细胞的代谢途径一直较受重视。通过代谢调控, 可以减少副产物的产生, 降低细胞的死亡速率, 还可以控制灌注速率和培养液成分, 控制细胞的状态和比生长速率, 以提高目标蛋白的产率。具体有以下方法。
3. 1　控制葡萄糖浓度法
      乳酸浓度升高,会导致比生长速率降低, 比死亡速率升高。乳酸的降低可更换葡萄糖为己糖如果糖或半乳糖 , 还可限制葡萄糖减少乳酸的生成, 使初始葡萄糖浓度较低, 在培养过程中再添加。在控制葡萄糖浓度法培养中, 生长期可以使葡萄糖浓度稍高, 以促进细胞生长; 在产物合成期降低葡萄糖的浓度, 降低乳酸的产生速率, 避免乳酸的积累, 减少毒害, 降低死亡速率, 维护持活细胞数在较高水平。同时还可以降低比生长速率, 增加目标蛋白的产生速率。
      灌注葡萄糖的同时, 要间歇或连续地加入其他组分, 以避免营养缺乏, 其中谷氨酰胺要保持在较低水平, 因为细胞的生长不依赖糖酵解 , 即使没有葡萄糖, 细胞仍可以通过降解谷氨酰胺获得能量。假如谷氨酰胺的浓度过高, 细胞就会偏向谷氨酰胺酵解, 从而削弱这种方法的效果。由于葡萄糖的价格相对低廉, 这种方法很有前途。
3. 2　控制谷氨酰胺法
    上面提到, 没有葡萄糖, 细胞可以利用谷氨酰胺作能量物质。因此, 控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些, 应用这一方法的报道也较多。控制谷氨酰胺浓度的目的, 主要是减少氨的产生。氨对细胞的毒性比乳酸大得多, 表现为降低比生长速率, 增加死亡速率。有人详细地研究了动物细胞的代谢过程, 采用底物限制补料分批工艺对动物细胞进行代谢控制。他采用这一方法, 使氨的浓度降低了一半。控制谷氨酰胺法与控制葡萄糖法一样, 要维持葡萄糖在较低水平。
3. 3　控制葡萄糖和谷氨酰胺法
      在细胞中, 葡萄糖代谢和谷氨酰胺代谢密切相关。葡萄糖消耗上升, 则谷氨酰胺消耗下降, 反之亦然。在相当大的一个范围内, 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率与其浓度成正比。控制葡萄糖和谷氨酰胺法可降低乳酸和氨的产生, 还能有效控制比生长速率。在细胞生长期, 提供充分的营养, 供细胞的需要; 在产物合成期, 降低葡萄糖和谷氨酰胺的浓度或流量, 降低比生长速率, 增加目标蛋白的产率。
3. 4　代谢产物的去除
    通常使用透析膜, 超滤腊或吸附剂选择性去除乳酸、氨或铵离子。有人建议加化学试剂比如钾盐来消除氨的影响 , 也有人建议可使用有谷氨酰胺合成酶的细胞。
　　灌注培养发展到现在, 还有许多急待解决的问题。其最大的缺点是培养基的利用不充分, 造成一定的浪费。随着细胞培养技术和产品分离技术的进一步发展, 建立细胞培养与产物分离的耦合系统(图2) , 能充分利用培养液, 降低生产成本, 一直是人们追求的目标, 这里就不赘述。
三 . 动物细胞无血清培养技术
      动物细胞无血清培养是生物科学领域中的重要研究课题之一。由于无血清培养基可以是完全采用已知分子结构和构型组分的低蛋白或无蛋白培养基。因而它不仅为研究和阐明细胞生长、增殖和分化的调节机制提供了有力的工具，而且为现代生物技术，尤其是细胞工程的应用准备了更好的条件。下面就动物细胞无血清培养基及其应用现状做一概述。
1 动物细胞培养基的发展过程：
      （1）天然培养基阶段
      （2）合成培养基阶段
      （3）无血清培养阶段
2 动物细胞培养中血清的作用和可能引发的问题
作用：
（1）提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。（2）提供可识别金属、激素、维生素和脂质的结合蛋白，并通过与上述物质的结合而起到稳定和调节上述物质的作用。此外结合蛋白还可消除某些毒素和金属对细胞的毒性作用。（3）提供贴壁细胞固着于适当的附着面所需的贴壁因子和扩展因子。（4）提供蛋白酶抑制剂，使细胞免受蛋白酶的损伤。（5）提供 PH 缓冲物质，调节培养基PH。（6）影响培养系统中的某些物理特性如：剪切力、黏度、渗透压和气体传递速度等。
可能引发的问题：
（1）在一些基础研究中，往往影响实验结果。
（2）血清中含有某些不利于细胞生长的毒性物质或抑制     物质，对某些细胞的体外培养有去分化作用。
（3）血清中大量成分复杂的蛋白质给疫苗、细胞因子、单克隆抗体等细胞产品的分离纯化带来很大困难。
3 无血清培养基的组成及其主要补充成分
（1）激素和生长因子
（2）结合蛋白
（3）贴壁因子和扩展因子
（4）低分子量营养因子
4 .无血清培养基的优缺点及其应用
优点：
（1）可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。
（2）避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。
（3）避免血清组分对实验研究的影响。
（4）有利于体外培养细胞的分化。
（5）可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。
已应用的领域有：
（1）研究细胞的分化条件
（2）用于激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究
（3）用于从多种细胞混杂的培养基中选择目的细胞
（4）肿瘤病理学和病因学的研究
（5）用于生产疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品
缺点：组要表现为细胞的适用范围窄，细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。
四. 动物细胞培养生物反应器
    细胞培养生物反应器是整个过程的关键设备,它要为细胞提供适宜的生长环境并决定着细胞培养的质量和产量。按照动物细胞的生长要求, 具备低的剪切效应、较好的传递效果和流体力学性质是这类反应器设计或改进所必须遵循的原则。
1 　搅拌式生物反应器
    搅拌式反应器靠搅拌桨提供液相搅拌的动力,它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性, 因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护, 因此对剪切作用十分敏感,直接的机械搅拌很容易对其造成损害, 传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以, 动物细胞培养中的搅拌式反应器都是经过改进的, 包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在反应器内加装辅件等。
1. 1 　供氧方式的改进
      一般情况下, 搅拌式反应器还常伴有鼓泡, 为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感, 所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。
    笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种, 即气泡用丝网隔开, 不与细胞直接接触。反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力, 以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞反应器, 整体呈梨形, 搅拌置于反应器底部, 在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡, 丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。
1. 2 　搅拌桨的改进
    搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大, 这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进, 并在反应器内加装了辅件, 实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨, 顶部的法兰盖上安装了3 块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°, 垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力, 实验中用于昆虫细胞的培养, 最终的培养密度达到6 ×106 个/ mL , 成活率在98 %以上。
2 　非搅拌式生物反应器
    搅拌式生物反应器用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大, 容易损伤细胞, 虽然经过各种改进, 这个问题仍很难避免。相比之下, 非搅拌式反应器产生的剪切力较小, 在动物细胞培养中表现出了较强的优势 .
2. 1 　填充床反应器
    填充是在反应器中填充一定材质的填充物, 供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供, 并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带, 因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小, 适合细胞高密度生长。
    Park 等人在由填充床反应器和外循环装置构成的连续流动的培养系统中培养动物细胞。反应器中的填料是带有微孔的陶瓷珠粒, 细胞在微孔内生长, 同时培养液也可以在孔内扩散。实验证明该反应器适于动物细胞的高密度培养, 细胞终期密度应器适于动物细胞的高密度培养, 细胞终期密度达到了5 ×108 个/ mL 。
2. 2 　中空纤维反应器
      中空纤维反应器 由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类反应器由中空纤维管组成, 每根中空纤维管的内径约为200μm , 壁厚为50～70μm。管壁是多孔膜, O2和CO2 等小分子可以自由透过膜扩散, 动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长, 可以很方便地获取氧分 。
      John 等报道了一个用于大规模培养动物细胞的径向流中空纤维反应器。该反应器内有一个垂直的中央分配管, 外面由中空纤维管与分配管呈平行组成一个环状床层。培养液由中央分配管径向流过中空纤维床, 细胞在中空纤维外壁贴附并生长。空气和CO2 的混合气体在中空纤维间与培养液成错流流过床层, 向细胞提供氧分并维持一定的pH值环境, 细胞的代射物随气流带出。在这个反应器中细胞生长的表面密度可达7. 3 ×106 个/ cm2 。
2. 3 　气升式生物反应器
    气升式生物反应器(airlift bioreactor) 也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一, 其特点是结构简单, 操作方便。
    有人在气升式反应器中利用微载体培养技术, 研究了Vero 细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero 细胞, 在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下,细胞可以正常生长至长满微载体表面, 终密度可达1. 13 ×106 个/ mL 。
4 　结　语
      动物细胞培养的关键设备是细胞培养反应器,主要解决的共性问题都是要按照动物细胞的生长要求, 使反应器具备低的剪切效应、良好的传递效果和流体力学性质。但在实际过程中, 这些原则总有一些相互制约的因素, 为了强化传递效果需要有一个充分的混合环境(包括气体鼓泡) , 但动物细胞的脆弱性制约了这个环境的形成;为提高培养介质中的溶氧度需要有较高的氧分压,不过, 高的氧分压也影响了代谢物的移出。同时,过高的氧分压也影响细胞的正常生长。如何优化这些制约, 是这类反应器开发中要解决的问题。在动物细胞培养中, 反应器的改进大多针对搅拌式反应器。虽然这类反应器剪切力大, 但由于它混合均匀、结构简单、操作方便以及良好的传递效果和操作弹性, 在大规模细胞培养中仍占有重要的位置 。
    目前, 研究工作要致力于开发高密度细胞培养反应器, 提高细胞生产率或生物产物的浓度。尤其组织工程的迅速发展, 对动物细胞生物反应器有了不同要求。要保持细胞离体培养时能具有同体内一样的三维异性结构、维持分化细胞的功能并支持细胞的高密度生长 , 培养过程要考虑种植有细胞的三维基质支架和生物反应器所组成的培养系统。事实上, 一种反应器的开发不可能满足动物细胞生长的所有要求, 同时也不可能适合所有的细胞培养方式。所以, 根据某种细胞的培养过程或细胞的某种培养方式, 开发专用反应器也许会比通用反应器有更好的效果。
五　其它方法：改变细胞特性
    在大规模动物细胞培养的初期, 细胞数量不断增加, 表达重组蛋白的能力也在逐步提高L细胞表达随细胞数量达到顶峰之后, 细胞数量和表达水平将下降L 因为用于生产具有重要医用作用的生物活性蛋白的工程细胞, 其基因组普遍整合了病毒载体, 这就从根本上决定了细胞最终命运是细胞凋亡L 目前已知参与细胞凋亡调控基因包括c2m yc、c2jun、bcl22、c2fo s、ras、p 53、bcl2x、bax 等,有些促进细胞凋亡, 有些抑制细胞凋亡L将抑制细胞凋亡的bcl22 基因导入细胞, bcl22 基因的过量表达可抑制Gln 或缺氧引起的细胞凋亡, 减少细胞特定营养成分的消耗, 提高细胞密度和目的蛋白产量L已证实bcl22 基因的过度表达可以提高灌流培养中杂交瘤细胞的活性和抗体的生产率.
六　结　语
    一项新的细胞培养技术的发展成熟需要较长的时间。大规模培养动物细胞是一项复杂而且经验性很强的工作L严格控制细胞培养的环境, 防止污染, 是进行大规模培养的前提L通过减少培养基中各种不利因素, 配置细胞生长的专一性无血清培养基, 以及选择条件温和、易操作、气体交换速度快的生物反应器和最适合细胞生长的微载体,可提高细胞的活性和表达水平