细胞器DNA的荧光显微观察

真核细胞内存在多种细胞器，如线粒体、质体、高尔基体、溶酶体和内质网。其中线粒体和质体携带自身的DNA。它们编码着线粒体和质体执行功能所必需的部分RNA，蛋白质并以特殊的方式遗传给子代。通常情况下线粒体和质体的DNA和质体的DNA被通称为细胞器DNA或细胞质DNA。

动物细胞的线粒体DNA大小在16kb左右。在同一种动物细胞中，线粒体DNA的分子大小总是相同的。比如人的线粒体DNA为16569bp,高等植物的线粒体DNA大小呈多态性。比如烟草细胞中的线粒体DNA的大小分布在3－100kb之间。质体存在于高等植物细胞中，质体DNA的分子大小未发现多态性。

由于细胞器的DNA分子很小，同时每个线粒体或质体中携带的DNA总量又十分有限，所以常规的DNA光学染色方法不能显示细胞器的DNA。目前，只有借助几种特别的荧光燃料和特殊的制样方法可以在荧光显微镜下直接观察到细胞器DNA。

一、实验原理

线粒体和质体的DNA通常情况下与特异的蛋白质结合形成紧凑的DNA•蛋白质复合体－拟核。在线粒体和质体的拟核中，DNA的密度远远高于间期的细胞核，甚至高于细胞分裂中期的染色体。当某种与DNA的特异性结合的荧光染料进入拟核后，便与DNA结合，在拟核内高度聚集。此时以适当波长的激发光照射拟核，拟核中聚集的荧光染料就会发生较强的荧光。这样，通过在荧光显微镜下观察拟核的荧光，便可以确定细胞器DNA的存在了。

YO－PRO－1是美国Molecular Probe公司新近开发的一种DNA特异性荧光染料。它可被波长为491nm的篮光激发，发出波长为509nm的黄绿色荧光。实验证明，YO－PRO－1是观察检测细胞器DNA的理想荧光染料之一。

二、目的要求

1．  了解荧光显微镜的基本结构、原理和使用方法；

2．  掌握细胞器DNA荧光染色观察的制样技术；

3．  用文字和简图记录所观察细胞的形态及细胞中细胞器的DNA的分布。

三、实验步骤

1．  荧光显微镜的基本结构、原理和使用方法（讲义略）

2．  细胞器DNA荧光染料观察的制样方法

取新近开放的迎春花一朵，置于放有湿滤纸的培养器中备用

↓

                    取干净的载玻片一片，置于一块大小适当地滤纸上

↓

                    在载玻片中央滴5ul 3％的戊二醛水溶液

↓

                    在戊二醛水溶中加5ul 1ug/ml YO－PRO－1染液

↓

                    用镊子夹取迎春花花药一个，轻抖少数花粉于载玻片上的染液中

↓

                    取干净的盖玻片一片，盖在染液上

↓

                    折回滤纸，使之能盖住盖玻片

                                      ↓

                    用大拇指通过滤纸给盖玻片施加一个斜方向的适当的压力，使花粉壁规则性破裂，内含细胞流出                                                                                 

↓

固定、染色5分钟，观察

3．  调整荧光显微镜滤片，用蓝光激发样品。观察迎春花的精细胞并进行记录。 

四、注意事项

1．  凡DNA特异性染料均有较强的致癌性。应尽量保持YO－PRO－1染料不与皮肤直接接触。万一染液接触皮肤，须立即用清水洗干净。

2．  为了取得较好的制样效果。每片载玻片上取得花粉不宜过多，一般不超过20粒。

3．  给盖玻片施压时用力必须得当，且一次完成，不可反复施压，也不可使盖玻片平向移动。否则会造成花粉壁无规则破碎或花粉内含物散乱，不易观

察到典型的精细胞。

五、          附注：

1．  O－PRO－1的分子量为629.32。结构式为：

2．  3％戊二醛起固定细胞内的蛋白质的作用，其溶剂为普通蒸馏水。

3．  YO－PRO－1染料是将商品YO－PRO－1母液在TAN缓冲液中稀释而成的。稀释的最终浓度为1ug/ml。YO－PRO－1商品母液和染液均需低温避光保存，TAN缓冲液具有保存细胞器拟核结构的作用。

TAN缓冲液：  20 mM Tris-HCl, pH7.6

0.5mM EDTA

1.2mM Spernudine

7mM  2－mercaptoethanol

0.4mM PMSF