关键词： 热休克蛋白；汉坦病毒；免疫组化；流行性出血热
热休克反应(heatshockresponse,HSR)是细胞在受到缺氧、氧化损伤、病毒感染和免疫紊乱等各种应激因素损伤时，为适应周围微环境的改变而作出的一种自身保护性反应。该过程以暂时性下调许多细胞本身产物和有选择性地上调热休克蛋白(heatshockprotein,HSP)的表达为特点[1]。HSP的诱导表达具有保护细胞免受微环境中各种有害因素的损伤，减小组织的梗死面积,减轻脏器损伤,以及降低致死性应激状态下动物死亡率的作用[2]。目前发现，有很多病毒可以诱导细胞热休克反应。我们在以往研究中发现，流行性出血热多种尸检组织中，有HSP70蛋白及其mRNA的表达，并与病毒抗原呈共存和相互抑制的关系。体外细胞培养证实，汉坦病毒感染可直接诱导HSP70表达，提示流行性出血热可诱导热休克反应[3]。我们以汉坦病毒感染乳鼠为实验模型，目的在于证明热休克反应是否可作为普遍规律也出现于动物感染汉坦病毒的过程中。
1 材料和方法
1.1材料待检标本为汉坦病毒感染的乳鼠脑组织。抗体包括:鼠抗病毒核蛋白单克隆抗体(mAb)1A8由本校微生物学教研室提供，抗HSP70mAb为SantaCruce公司产品，兔抗病毒多克隆抗体由唐都医院传染科提供。鼠抗PAP复合物购自武汉生物制品研究所，FITC标记的山羊抗兔抗体及生物素化羊抗鼠抗体均为博士德公司的产品。AvidinTexasRed为Sigma公司产品。MRC1024激光共聚焦显微镜为BioRad公司产品。
1.2方法
1.2.1乳鼠实验性汉坦病毒感染取出生后48～72h的昆明种乳鼠,经腹腔接种陈株汉坦病毒。分别于接种病毒后不同时间点处死动物,取其脑组织，用40mg/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，连续切片(厚5μm)。
1.2.2免疫组化检测组织切片常规脱蜡至水，加800mL/L甲醇—双氧水室温处理40min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。依次加40mL/L正常羊血清(37℃孵育30min)、稀释的mAb1A8和抗HSP70mAb(4℃孵育48h),再以羊抗鼠为桥抗的多重PAP法显示抗原，底物为0.1g/LDAB和0.01mL/L双氧水。实验中以PBS和无关mAb作为阴性对照。
1.2.3激光共聚焦显微镜检测基本步骤同前。将稀释的兔抗病毒多克隆抗体和鼠抗HSP70mAb滴加于同一组织上，4℃孵育48h后，依此滴加生物素化羊抗鼠抗体、FITC标记的山羊抗兔抗体及AvidinTexasRed(均在37℃孵育30min)，于激光共聚焦显微镜下观察。
2 结果
病毒感染1d的乳鼠脑组织中,病毒抗原呈阴性;感染后2d的乳鼠脑组织中,开始出现病毒抗原,但染色强度较弱,定位于神经细胞的胞浆内;病毒感染8d的乳鼠脑组织中,病毒抗原的染色最强,广泛分布于皮层下、海马回和小脑蒲肯野细胞层等部位。病毒感染后10，12和14d的脑组织中,病毒抗原阳性的细胞逐渐减少,且倾向于灶性分布。HSP70表达的强度及部位与病毒抗原的检出始终保持一致。HSP70在围绕坏死区周围的组织细胞中表达量较高，表达细胞为受损伤但未坏死的细胞，发生梗死样坏死的细胞未见HSP70表达。
用间接免疫荧光双标记法结合激光扫描共聚焦显微镜，观察感染病毒后8d的乳鼠脑组织中有FITC标记的病毒抗原(呈黄绿色颗粒)及TexasRed标记的HSP70(呈红色颗粒)，均位于细胞浆内(照片未附)。共聚焦观察，可见病毒抗原和HSP70在胞浆内部分重叠，呈黄色颗粒荧光,表明汉坦病毒抗原与HSP70具有共定位的关系。
3 讨论
病毒感染是诸多诱导热休克反应的应激因素中重要的一种,不同病毒可诱导不同的HSP表达，甚至同一种病毒在不同类型的细胞内诱导的HSP的类型及反应强度也不相同[4]。我们通过体外实验发现，汉坦病毒感染VeroE6细胞可直接诱导HSP及其mRNA表达,提示汉坦病毒的感染参与了热休克反应的诱导。
本实验中还发现，病毒感染的乳鼠脑神经细胞中有HSP70表达，主要定位于胞浆中。HSP70与病毒抗原的表达一致，即在感染了病毒的组织中总能检测到HSP70的表达；反之则检测不到，且HSP70的定位与组织病变相一致。HSP70与应激状态下细胞内新合成的或发生部分变性的蛋白质具有亲和性,可限制其变性或聚合,并利用ATP水解产生的能量使之恢复正常功能。否则，可在ATP依赖的方式下刺激溶酶体将其摄取并降解[5]。HSP还可抵抗某些细胞毒性因素及TNF-α等引起的细胞凋亡,延长细胞的存活,因此,HSP的表达具有一定的细胞保护作用。另外，HSP的表达有助于病毒的复制和装配，当它在病毒感染的细胞中表达时，能够激活免疫反应，而在某些情况下HSP与病毒蛋白的结合则可抑制病毒的复制。本实验为进一步探索将HSP及病毒抗原的融合蛋白作为新一代疫苗，用于流行性出血热的防治打下了基础。■
基金项目：国家自然科学基金资助, No.39770664
作者简介:赵君,女,29岁,助教,硕士生西安市长乐西路17号 , Tel.(029)3374541
参考文献：
[1]Linquist S. The heat shock response[J]. Annu Rev Biochem ,1986； 55:1151－ 1191.
[2] Macario AJ. Heat shock proteins and molecular chaperones :implications for pathogenesis ,diagnostics,and therapeutics[J]. Int J Clin Lab Res, 1995;25(2):59－ 70.
[3] 叶 苓 ， 杨 守 京 ， 刘 彦 仿 . 流 行 性 出 血 热 病 例 组 织 中 热 休 克 蛋 白 表 达 的 原 位 杂 交 和 免 疫 组 化 研 究 [J]. 中 国 病 毒 学 , 1998; 13(4)： 327－ 331.
[4] Sedger L. Heat shock response to vaccina virus infection[J]. J Virol, 1994;68(7):4685－ 4689.
[5] Terlecky SR, Chiang HL, Olson TS, et al. Protein and peptide binding and stimulation of in vitro lysosomal proteolysis by the 73 KD heat shock conjugate protein[J]. J Biol Chem, 1992;267(13)： 9202－ 9209.
原癌基因产物Ras及cerbB