微电泳实验

基本原理：外加电流通过含解离物质溶液的微电极时，会将微电极内的解离物质从管尖释放出来。如微电极接正极，头皮接负极（外向电流），阳离子物质就从微电极释出。微电泳的解离物质从微电极释出量与它通过的电荷量成正比。常用微电极电流强度来表示解离物质的释出量。

器材：五、或七管微电极，一般每管尖端直径约1μm，七管总直径5-8μm.。若充灌的 是小分子物质，如NMDA、Glu等，则每管尖端直径可以是0.5μm, 七管总和为3-4μm，这样可使记录管电阻高达5MΩ-10MΩ，周边管达40MΩ-100MΩ，不仅能满足电泳要求，还能记录到较大的电位。若充灌的是大分子肽类，则直径要大一些，一般不能超过10μm，否则易致泄漏，且电痊记录过小。但本法虽然解离量与电流成正比，但不同的微电极或不同的物质的实际释出量有很大差异，且无规律可循。应将微电泳与整体功能结合起来，才能得出正确的结论。

微电极充灌一般多为较高浓度的NaCl (4mol)或KCl (3mol)以使电极尖端获得高离子浓度，从而得到低阻抗微电极。其中一个周边管充以150mmol/L NaCl作平衡电流用，其余根据需要充不同灌注液。充灌方法有许多种，压力法，充灌注，真空法，酒精法等，最常用的是玻璃纤维法。

充灌液：（1）浓度：增加传导性并减少噪声，可用较高浓度的溶液，以使所要电泳的离子具有较高的浓度和稳定形式一般微电泳溶液浓度为5-500mmol/L不必过大。对于效能很强的化学物质，可用150mmol/L的NaCl作为溶剂，溶液浓度尽量低，以防止因药物扩散引起的生物学效应。（2）pH值：常用低浓度（0.1N）盐酸或NaOH将溶剂调整到适当的pH值，以增加溶质的溶解度和稳定度。但有些物质，如中性氨基酸难以离子化。此时可参考其pKa值调整，使pH=pKa-1，这可使90%氨基酸离子化。根据经验，一般pH为3.5-4.0。完全不能离了化物质可用微压力法注射。另外，充灌注一定要干净，避免污染。（3）防止药物漏出，可通过持续施加一个带极性的“迟滞电流”来防止。迟滞电流的极性方向与所要电泳的离子所带电荷相反，这样使得所要电泳的离子向回移动（对抗漏出），从而使尖端离子浓度降低，一般电流大小应根据实际情况具体调整，一般为10-30nA。有些效能很强的物质则需施加较大的迟滞电流。（4）注射电流。其大小和持续时间以能产生预期的生物学效应为标准。注射电流的极性方向与迟滞电流方向相反，即和甩要电泳的离子所带电荷相同。在电泳时，要注间几个问题：其一：电流伪迹，一般大多微电泳仪均能进行自动电流平衡，一般不会产生伪迹，但手工操作时应注意。其二：电噪声。如果所要电泳的药物的溶解度和离子化程度低，则其传导性也低，而传导性越低，就越易产生较高的电噪声。在较高电噪声下，即使维持稳定的注射电流，但其对离子的泳出率也往往大大偏离理论值，可采用下列方法克服：尽可能选用尖端大的电极，可达10μm左右；将该物质充灌于周边多个周边管中，实施电泳时分别是以较小的注射电流同时从几个管内将药物排 出，这样可减少噪声，如果所要电泳的药物的溶解度和离子化程度较高，则噪声一般不成问题。其三：注射电流的定量。许多情况下，电泳某药物观察其生物学效应时需要重复几次并且给一个固定剂量。由于迟滞电流的存在，使得电极尖端的药物浓度降低，所以一开始后的即早期，所排出的药物较少，随后逐渐上升至一个平台。这取决于注射电流的大小和开始电泳时电极尖端离子浓度的高低。因此重复给药时，应该以固定程序进行：固定大小的注射电流、固定的注射时间（应足以使药物释出和反应达到平台值）、固定间隔时间等，达到相对定量的目的。