细胞生物学实验-植物原生质体融合

    植物原生质体融合在理论和实践上都有很大的意义，在植物遗传工程和育种研究上具有广阔的应用前景。它是植物同源、异源多倍体获得的途径之一，它不仅能克服远源杂交有性不亲和障碍，也可克服传统的通过有性杂交诱导多倍体植株的麻烦，最终将野生种的远源基因导入栽培种中。原生质体融合技术可望成为作物改良的有力工具之一。

一、目的与要求

了解植物原生质体融合的基本原理及其过程。

二、基本原理

许多化学、物理学和生物学方法可诱导原生质体融合。现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二烯（PEG）法、高Ca高pH法和电融合法。

PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随和用高Ca高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。

PEG诱导融合的机理：PEG由于含有醚键而具负极性，与水、蛋白质和碳水化合物等一些正极化集团能形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Ca^2＋等阳离子。Ca^2＋可在一些负极化基才和PEG之间形成桥，因而促进粘连。在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这样将引起电荷的紊乱和再分布，从而引起原生质体融合。高Ca高pH由于增加了质膜的流动性，因而也大大提高了融合频率。洗涤时的渗透压冲击对融合也可能起作用。

三、实验内容

1．  原生质体分离

2．  原生质体融合

3．  融合体的识别

四、实验步骤

1.溶液的配制

（1）       酶液

1％纤维素酶

1％果胶酶

        0.7mol甘露醇

           0.7m mol碳酸二氢钾

           10m mol二水合氯化钙

           pH6.8~7.0

（2）       PEG融合液

40%        PEG   (MW1500－6000)

       0.3 mol     葡萄糖

       3.5m mol   二水合氯化钙

       0.7mol      碳酸二氢钾

(3)    13%CPW洗液

       27.2         mg/L碳酸二氢钾

       101.0        mg/L硝酸钾

       1480.0       mg/L二水合氯化钙

       246.0        mg/L七水合硫酸镁

       0.16         mg/L碘化钾

       0.025        mg/L五水合硫酸铜

       13%         W/V甘露醇

pH           6.0

    （4） 20％蔗糖溶液

2.原生质体的分离

将撕去表皮的植物叶片或花瓣置于酶液（去表皮面接触酶液），在25℃黑暗条件下，酶解1～2小时。用200目网过滤除去未完全消化的叶片等残渣。在1000rpm条件下离心5分钟，弃上清液。加入3～4ml13%CPW洗液，相同条件下离心2分钟，弃上清，留1ml洗液。用滴管将混有原生质体的1ml洗液吸出，轻轻铺于20％蔗糖溶液上（5ml离心管装3ml20％蔗糖溶液），在1000rpm条件下离心5～10分钟，由于密度梯度离心的作用，生活力强状态好的原生质体悬浮在20％蔗糖溶液与13％CPW溶液之间，破碎的细胞残渣沉于管底。

     用200ml的移液器轻轻将状态好的原生质体吸出（注意尽可能不要吸入下层的蔗糖溶液），放入另一干净的离心管中，加入4ml13％CPW洗液，1000rpm离心2分钟，弃上清，用血球计数板调整原生质体密度为10⁵－10⁶之间。

1.       原生质体融合

 将1～2滴原生质体混和物（密度为10⁵－10⁶之间）滴入小培养皿（或载玻片上），静置8～10分钟，相对方向加入2滴40％的PEG溶液，静置10分钟，依次间隔5分钟加入0.5ml、1ml和2ml含13％甘露醇的CPW洗液洗涤，注意在第二、第三次洗液加入前，用移液器轻轻吸走部分溶液，但不能洗干，否则原生质体破碎死亡。最后用培养基洗1～2次即可进行培养。

2.       观察

两种原生质体加入PEG融合液后，只发生粘连，在洗涤过程中才发生膜融合，核融合通常于融合体第一次有一次分裂过程中发生。

五、思考题

    1．简述植物原生质体融合培养研究的实践意义。

    2．哪些因素会影响原生质体融合？