（4）膜流动性的研究方法：①人鼠细胞融合实验②淋巴细胞的成斑、成帽实验③荧光漂白恢复④电子自旋共振谱技术。

（5）影响膜流动的因素：①温度对膜流动的影响：为膜流动的最主要影响因素，膜骨架的成分-脂分子既可以晶态，又可以液态存在，主要是根据温度的变化而定。例如用磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺构建的人工脂双层结构，37℃时，是以相对相对流动的业态存在，呈现典型的而维液晶。如果温度慢慢的降低达到某一点时，脂就会由正常的拟液态（liqudlike state）变成冷冻的晶体胶态（frozen crystalline gel）,磷脂的运动大受限制。②膜脂的结构和组成对膜流动性的影响：主要表现在4个方面A）脂肪酸链的长度：与相变温度成正比，即越长相变温度越高，因此膜中长链脂肪酸含量越高则膜的流动性越低。反之，膜中短链脂肪酸含量越高，膜的流动性越高。B）脂肪酸链的不饱和程度：不饱和脂肪酸比饱和脂肪酸具有较低的相变温度，膜中不饱和脂肪酸含量高，则膜的流动性大。C）胆固醇对膜流动的调节作用：真核细胞膜中含有大量的胆固醇插在磷脂之间，胆固醇的甾环区与磷脂分子的酯酰链相互作用，可以加强膜脂的稳定性，调节膜的机械性能。在相变温度以上，胆固醇可使磷脂分子酯酰链末端甲基运动减小，即限制膜的流动性。在相变温度以下，胆固醇可增加酯酰链的运动，增强膜的流动性。因此将胆固醇称为“可塑分子”（plasticizer）。胆固醇的可塑性对于动物细胞质膜具有重要意义，所以一些动物细胞质膜中磷脂与胆固醇的比值可达到1：1；但核膜中为1：（0.1～0.2），在线粒体膜中只有1：（0.02～0.05）因为在这些细胞器中，胆固醇存在的意义不大。胆固醇除了调节膜的流动性外，在磷脂双层中还有其他作用。它能够迫使磷脂的头部分开，促使膜表面的分子穿过内层。通过这种影响，胆固醇帮助结合在膜表面的蛋白质分子进入细胞。虽然胆固醇能够促进蛋白质进入细胞，但也能促使脂双层磷脂的尾部合拢，以阻止离子和一些物质（如葡萄糖）的进入。D）卵磷脂和鞘磷脂的比值对膜流动的影响：哺乳动物膜中卵磷脂和鞘磷脂的含量约占膜脂的50%，其中卵磷脂所含的脂肪酸不饱和程度高，链较短，相变温度低。因此，若卵磷脂含量高则流动性大。而鞘磷脂则与之相反，它含的脂肪酸链的饱和度高，相变的温度也高，因此，若鞘磷脂的含量高，则流动性低。在37℃时，两种脂均处于流动状态，但后者的微黏性较大。衰老的细胞膜和动脉硬化的细胞膜上的卵磷脂和鞘磷脂的比值低，流动性低。③膜蛋白对膜流动性的影响：虽然膜蛋白能够在膜中进行侧向扩散和旋转运动，但由于膜蛋白与膜脂的结合是功能性的，它必然要以某种方式同细胞内、细胞外、细胞与细胞间发生联系，组成特殊的膜区，这样膜蛋白的运动受到限制，从而影响膜的流动性。膜蛋白限制膜流动的因素有A）细胞质膜下的骨架结构与膜整合蛋白结合限制膜蛋白移动。B）细胞外基质中的某些分子与膜整合蛋白结合限制膜蛋白移动；C）膜蛋白与另一细胞的膜蛋白作用限制了自身移动；D）膜中其他不动蛋白限制了膜蛋白的移动。

图1-13膜脂不同状态（引自David L.Naison et.al,4#th）

2、膜的不对称性：包括膜脂、膜糖和膜分布的不对称性和这些分子在方向上的不对称性。

（1）膜脂的不对称性：表现在膜两侧分布的各类脂的含量比例不同，各种细胞的膜脂不对称比例差异很大。由于膜脂在两侧分布的差异造成不同膜区的功能各异。

（2）膜蛋白的不对称性：膜蛋白的分布是绝对不对称得，包括不同蛋白分布的不对称，同一蛋白中氨基酸残基种类、数目的不对称。例血影蛋白分布在红细胞膜的内表面。一些酶和受体出与膜的外表面。

（3）膜糖的不对称性：糖脂均分布在动物细胞的外表面。糖蛋白的糖基在质膜也是分布在脂双层的外叶。

（4）不对称性的研究方法：包括冷冻断裂法；放射性标记法；脂酶处理法。

图1-14红细胞质膜中磷脂分布的不对称性（引自David L.Naison et.al,4#th）

1.4 内膜系统与蛋白质的分选

一、细胞内膜系统

细胞内膜系统（endomembrane system）是指细胞内在结构、功能及发生上相关的由膜包被的形成的细胞器或细胞结构。如核被膜、内质网、高尔基体、溶酶体、胞内体和分泌泡等。

1、内质网（endoplasmic reticulum.ER）

（1）形态结构：内质网有两种基本类型①粗面内质网（rough endoplamic reticulum,rER），有核糖体附着，呈扁平囊状，排列整齐，内质网上存在易位子。易位子是一种蛋白复合体，中心有一直径2nm的通道，其功能与新合成的多肽进入内质网有关。②光面内质网（smooth endoplasmic reticulum）,sER）无核糖体，呈分支管状或小泡状。

（2）内质网的主要功能：合成几乎全部脂质和多种重要蛋白质，还能合成糖类物质。①协助蛋白质合成：A）细胞中蛋白质都是在核糖体上合成的，并都是起始于细胞质基质中“游离”核糖体；B）粗面内质网主要合成分泌蛋白、整合膜蛋白、内膜系统各种细胞器中的可溶性蛋白以及需要隔离或修饰的特殊蛋白质；C）其他的多肽是在细胞质基质中“游离”核糖体上合成的。②蛋白质的修饰与加工：包括糖基化、酰基化、羟基化、二硫键形成等。糖基化是内质网中最主要的蛋白修饰。糖基化在糖基转移酶作用下发生，包括A）N-连接的糖基化（N-linked glycosylation）：N-乙酰葡萄糖胺与天冬酰胺残基的NH3连接，在粗面内质网中进行；B）O-连接的糖基化（O-linked glycosylation）：半乳糖或N-乙酰半乳糖胺鱼丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸残基的-OH连接，主要在高尔基体内进行。酰基化主要指软脂酸与半胱氨酸共价结合，发生在ER的细胞质基质侧。③新生肽的折叠预组装：A）易位子将错误折叠或组装的蛋白质转运至细胞质基质，进而被蛋白酶降解；B）蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）切断二硫键，帮助新合成的蛋白重新形成二硫键并处于正确折叠状态；C）结合蛋白（binding protein,Bip）识别错误折叠或未装配好的蛋白亚单位，并促进重新折叠与装配。二硫键酶和结合蛋白都具有KDEL或HDEL信号蛋白，因而滞留在内质网中。④脂质合成：ER合成细胞所需绝大多数膜脂（包括磷脂和胆固醇）。合成后以出芽的方式转运至高尔基体、溶酶体和质膜上，或借磷脂转移蛋白（PTP）形成水溶性复合物，转至其他膜上。⑤其他功能：A）类固醇激素的合成（生殖腺内分泌细胞和肾上腺皮质）；B）肝的解毒作用；C）肝细胞葡萄糖的释放；D）贮存钙离子：肌质网膜上的Ca2+-ATP酶将细胞质基质中Ca2+泵入肌质网腔中；D）提供酶附着的位点和机械支撑作用。

（3）内质网与基因表达的调控：三种信号反馈调节细胞核内的特异基因表达：A）内质网腔内未折叠蛋白的超量积累；B）折叠好的膜蛋白的超量积累；C）内质网膜上膜脂成分的变化——主要是固醇缺乏。不同的信号转导途径，最终调节细胞核内特异基因表达。

2、高尔基体（Golgi body）

（1）形态结构：电镜下：高尔基体是由扁平膜囊和大小不等的囊泡构成。高尔基体是有极性的细胞器，靠近核膜的一面，扁囊弯曲成凸面，又称形成面或顺面；面向质膜的凹面又称成熟面或反面。高尔基体至少由互相联系的4个部分组成，每一部分又可划分为更精细的间隔：①顺面网状结构（cis-Golgi network,CGN）又称顺面膜囊：是中间多孔，呈连续分支管网结构。主要功能：A）内质网合成的大部分蛋白质和脂类进入CGN，带有KDEL或HDEL信号的蛋白质返回内质网；B）发生O-连接糖基化；C）日冕病毒的装配。②中间膜囊（medial Golgi）：是由扁平膜囊和管道组成。主要功能：进行蛋白糖基修饰、糖脂的形成、与高尔基体有关的多糖的合成。③反面网状结构（trans Golgi network,TGN）以及反面膜囊：呈管网状，TGN中的PH值较低，标志酶CMP酶可显示TGN。主要功能：参与蛋白质的分类和包装、运输；某些“晚期”的蛋白质修饰；在蛋白质与脂类的转运过程中发挥“瓣膜”作用，保证单向转运。④周围大小不等的囊泡：与物质运输有关。

高尔基体与细胞骨架关系密切。在非极性细胞中，高尔基体分布在MTOC（负极）；高尔基体的膜囊上存在微管和微丝的马达蛋白。它们在维持高尔基体动态的空间结构以及复杂的膜泡运输中起重要作用。

（2）高尔基体的功能：对内质网合成的蛋白进行加工、分类、包装、转运；转运内质网合成的脂质；合成糖类。①参与细胞的分泌活动A）3H-亮氨酸对胰腺腺泡细胞进行脉冲标记实验显示：分泌性蛋白在细胞内的转运过程是通过高尔基体完成的。其他许多蛋白的转运也可由高尔基体完成，如膜蛋白等。B）溶酶体酶蛋白的M6P分选途径：在顺面膜囊，溶酶体酶被修饰，产生M6P标志，进入反面膜囊后，具有M6P的溶酶体酶与M6P受体结合，在局部浓缩并转运至溶酶体，从而使溶酶体酶与其他蛋白相分离。在肝细胞中溶酶体酶存在不依赖于M6P的另一种分选途径。C）蛋白质自身所携带的分选信号决定带白质的去向（分泌到细胞外基质，或进入溶酶体，或转运至细胞膜）。例如：流感病毒包膜蛋白特异地转运至上皮细胞游离端的质膜，而疱疹性口炎病毒包膜蛋白特异性的转运至上皮细胞的基底面质膜。是由于疱疹性口炎病毒包膜蛋白的双酸分选信号（Asp-X-Gln或DXE）起重要作用。D)分泌性蛋白的分泌过程：rER膜上合成的蛋白质→进入ER腔→COPⅡ运输泡→进入CGN→在中间膜囊加工→在TGN形成小泡→小泡与质膜融合、排除。②蛋白质糖基化及其修饰A）蛋白质糖基化的基本类型：N-连接的糖基化；O-连接的糖基化。B）蛋白质糖基化的特点及其生物学意义：糖蛋白寡糖链的合成与加工没有膜板，靠不同的酶在细胞中经历复杂的加工过程才能完成；糖基化作为部分蛋白质的分选信号，以利于分类、包装和装运；对多数有高尔基体分选的蛋白质来说，糖基化的主要作用是：使蛋白质在成熟过程中折叠成正确构象，增加蛋白质的稳定性，多羟基糖侧链影响蛋白质的水溶性及蛋白质所带电荷的性质；进化上的意义：寡糖链具有一定的刚性，从而限制了其他大分子接近细胞表面的膜蛋白，这就可能使真核细胞的祖先具有一个保护性的外被，同时又不象细胞壁那样限制细胞的形状与运动。C）蛋白聚糖在高尔基体中装配：一个或多个糖胺聚糖结合到核心蛋白的Ser残基上，与丝氨酸相连的是木糖，而不是N-乙酰半乳糖胺（与O-连接的糖基化区别）。③蛋白质在高尔基体中酶解加工：A）无活性的蛋白原切除N端或两端的序列形成成熟多肽。如胰岛素、胰高血糖素及血清白蛋白等；B）含有多个相同氨基酸序列的蛋白质前体水解形成同种有活性的多肽，如神经肽等；C）含有不同信号序列的蛋白质被加工成不同的产物；D）同一种蛋白质前体在不同细胞、以不同的方式加工形成不同的多肽。

3、溶酶体与过氧化物酶体

（1）溶酶体（lysosome）的结构与类型：A）结构特征：存在于几乎所有的动物细胞中，单层膜包被、内含多种酸性水解酶的囊泡状细胞器。溶酶体在不同细胞内形态数量迥异，同时执行不同生理功能，具有异质性。其主要功能是进行细胞内的消化作用。酸性磷酸酶是常用的溶酶体标志酶。B）类型：根据所处的生理功能阶段分为以下几种：初级溶酶体（primary lysosome）：直径约0.2-0.5μm，含多种酸性水解酶，但没有活性，包括蛋白酶、核酸酶、脂酶、磷酸酶等60余种，反应的最适PH值为5左右。溶酶体膜的特征：嵌有质子泵，形成和维持溶酶体酸性的内环境；具有多种载体蛋白用于水解产物向外转运；膜蛋白高度糖基化，有利于防止自身膜蛋白的降解。B）次级溶酶体（secondary lysosome）：是正在进行或完成消化作用的溶酶体，内含水解酶和相应的底物，可分为自噬溶酶体（autophagolysosome）和异噬溶酶体（phagolysosome）。C）残余小体（residual body）：又称后溶酶体（post-lysosome），已失去酶活性，仅留未消化的残渣。残体可通过外排作用排出细胞，也可能留在细胞内逐年增多，如表皮细胞的老年斑、肝细胞的脂褐质。

（2）溶酶体的功能：A）清除作用：清除无用的大分子、衰老的细胞器及衰老损伤和死亡的细胞。溶酶体酶缺失或溶酶体酶代谢出现故障，将影响细胞代谢，引起疾病。如台-萨氏（Tay-Sachs）等各种储积病（隐性遗传病）。B）防御作用：机体被感染后，病原体刺激单核细胞分化成巨噬细胞，从而发挥吞噬、消化功能。某些病原体（结核杆菌、麻风杆菌、利什曼原虫或病毒）被细胞摄入，进入吞噬泡但并未被杀死而繁殖，其原因是抑制了吞噬泡的酸化。C）营养作用：作为细胞内的消化“器官”为细胞提供营养。D）参与形成赘生组织或退行性变化的细胞。E）参与分泌过程调节。F）精子的顶体相当于特化的溶酶体，受精过程发生顶体反应，促进受精。

（3）溶酶体的发生：①依赖M6P的溶酶体分选途径：在粗面内质网，内质网上核糖体合成溶酶体酶蛋白→进入内质网腔，进行N-连接的糖基化修饰→在高尔基体顺面膜囊，寡糖链上的甘露糖残基磷酸化成M6P→与高尔基体反面膜囊和反面网状结构膜上M6P受体结合→以出芽方式转运到前溶酶体→运输小泡与前溶酶体融合，溶酶体酶进入前溶酶体，而M6P受体返回高尔基体。②溶酶体蛋白的其他分选途径：A)依赖于M6P的分选效率不高，部分含有M6P标志的溶酶体酶通过运输小泡直接运输到细胞外。B）在细胞质膜上还存在依赖于钙离子的M6P受体，与胞外的溶酶体酶结合，通过受体介导的内吞作用，将酶运送至前溶酶体中，M6P受体返回细胞质膜，反复使用。C）还存在不依赖于M6P的分选途径，如Txibao溶酶体中的酶通过不依赖于M6P的途径进入溶酶体。溶酶体膜蛋白不具有M6P标志。酸性磷酸酶的分选也不涉及M6P途径。

（4）溶酶体与过氧化物酶体：①区别：过氧化物酶体中的尿酸氧化酶等长形成晶格结构，可作为电镜下识别的主要特征；通过离心可分离二者。

②过氧化物酶体在不同细胞具有不同功能A)在动物细胞中的氧化解毒作用，过氧化物酶体中常含有两种酶：依赖于黄素（FAD）的氧化酶，其作用是将底物氧化成H₂O₂；过氧化氢酶，作用是分解H₂O₂，形成水和氧气。B）过氧化氢酶体可能参与脂肪酸的β-氧化，向细胞直接提供热量。C）植物细胞：在绿色植叶肉细胞中，它催化CO2固定反应副产物的氧化，即所谓光呼吸反应；在种子萌发过程中，降解贮存的脂肪酸，发生乙醛酸循环反应。③过氧化物酶体的发生：A）过氧化物酶体经分裂形成子代的过氧化物酶体，在进一步装配成成熟的细胞器。B）组成蛋白均由核基因编码，在细胞质基质中合成，然后转运到过氧化物酶体中。C）过氧化物酶体蛋白的分选信号序列（PTS）：PTS1多存在于基质蛋白的C端。PTS2存在于某些基质蛋白的N端。过氧化物酶体膜上存在几种可与信号序列相识别的可能的受体蛋白。D）过氧化物酶体的膜脂可能在内质网合

图1-15细胞内膜系统(引自Lodish et.al 2004)

图1-16高尔基体（引自Lodish et.al 2004）

二、细胞内蛋白质的分选与细胞结构的组装

1、蛋白质分选（protein sorting）：绝大多数蛋白质均在细胞质基质中的核糖体上起始合成，随后继续在细胞质基质中，或转运至粗面内质网上继续合成。合成完毕后，再通过不同的途径转运到细胞的特定部位并装配成结构与功能的复合体参与细胞活动，这一过程称为蛋白质分选。

图1-17真核细胞中蛋白质的分选概括(引自Lodish et.al2004)

2、信号假说与蛋白质分选信号

①信号序列的一般特征：A）长度一般为15-35个氨基酸残基，N端含有1个或多个带正电荷的氨基酸，其后是6-12个连续的疏水残基；B）在蛋白质合成中将核糖体引导到内质网，进入内质网后通常被切除。信号序列有两个基本作用，一是通过与SRP的识别和结合，引导核糖体与内质网结合；二是通过信号序列的疏水性，引导信号肽跨膜转运。

②信号识别颗粒（signal recognition partical,SRP）：是一种核糖核蛋白复合物，沉降系数为11s，含有分子质量为72、68、54、19、14、及9kDa的6条多肽和一个7S（长约300个核苷酸）的scRNA。SRP有3个功能部位：翻译暂停结构域（P9/P14）、信号肽识别结合位点（P54）、SRP受体蛋白结合位点（P68/P72）。SRP能够识别刚从有利核糖体上合成出来的信号肽，并与之结合，暂时终止新生肽的合成；同时与内质网上的停靠蛋白结合，使核糖体附着到内质网膜上，并进行新生肽的转移。SRP对正在合成的其他无信号序列的蛋白质无作用，这些游离核糖体也就不能附着到内质网膜上。SRP已分离。

③停靠蛋白（docking protein,DP）：含有两个亚基，一个亚基是暴露于细胞质的亲水部分，由640个氨基酸组成；另一个亚基是嵌入膜的疏水部分，由300个氨基酸组成。DP是SRP在内质网膜上的受体蛋白，它能够与结合有信号序列的SRP牢牢结合。使正在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上。SRP受体蛋白已分离，且为一种G蛋白，它对分泌蛋白的转运具有重要的调节作用。受体蛋白与GTP结合，表示是活性状态，能够与SRP结合，如果结合的是GDP是非活性状态，不能与SRP结合。

图1-18信号识别颗粒的组成（引自Lodish et.al 2004）

④蛋白质共翻译转运机制—信号肽假说

A）ER转运蛋白合成的起始。通过ER转运的蛋白质合成起始于胞质溶胶的游离核糖体，核糖体是蛋白质合成的装置，它不决定蛋白质的去向，合成的蛋白质何去何从，是由mRNA决定的，也就是由密码决定的（地址签address target）.B）信号序列与SRP结合。SRP的信号识别位点识别新生肽的信号序列并与之结合；同时，SRP上的翻译暂停结构域同核糖体的A位点作用，暂时停止核糖体的蛋白质合成。C）核糖体附着到内质网上。结合有信号序列的SRP通过它的第三个结合位点与内质网模中受体（停靠蛋白）结合，将核糖体附着到内质网的蛋白质转运通道（protein translocating channel）.D)SRP 的释放与蛋白质转运通道的打开。当SRP-信号序列-核糖体-mRNA复合物锚定到内质网膜后，SRP受体将其结合的GTP水解同时将SRP释放出来，此时蛋白质转运通道打开，核糖体与通道结合，新生的肽插进通道。释放的SRP又回到胞质溶胶中循环使用。内质网蛋白转运通道是一个多蛋白的复合体，详细地作用尚不清楚。

以上的A-D的过程是核糖体与内质网附着过程，是蛋白质共翻译转运中最重要的步骤。

E）随着SRP的释放，蛋白质的合成重新开始，冰箱内质网腔转运，在此过程中不需要能量驱动。F）信号肽酶切除信号肽序列。当转运完成后，若转运多肽的信号序列时可切割的序列则被内质网中信号肽酶（signal peptidase）所切割，释放出可溶性的成熟蛋白质，切下的信号序将被降解。G）蛋白合成结束。此时蛋白转运通道关闭，核糖体与内质网分离，进入胞质溶胶开始新的蛋白质合成。以上E-G是分泌蛋白向ER腔的转运过程。

图1-19分泌蛋白的合成及共转运进入内质网腔示意图（引自Lodish et.al 2004）

⑤膜蛋白的共翻译转运机理：

在糙面内质网上合成的蛋白质有两类：一类如前所述的分泌蛋白，在内质网上合成以后通过对信号切除，即可释放到内质网腔中成为和溶性蛋白，在进行下游途径的运输；二是膜整合蛋白的共转运翻译，较复杂，首先它要靠疏水区滞留在内质网膜上；另外膜蛋白又分单次跨膜和多次跨膜蛋白，还有膜蛋白在膜上的定向问题，即羧基端和氨基端的方向，在内质网膜的内侧、外侧、还是同侧。这些在跨膜转运之始就要有定论。膜蛋白的跨膜转运同样用信号肽假说进行解释。（如图1-20）

A）起始转移信号（start-transfer signal）：蛋白质氨基末端的信号序列除了作为信号被SRP识别外，还具有起始穿膜转移的作用。在蛋白质共翻译转运过程中，信号序列的N端始终朝向内质网的外侧，插入蛋白质转运通道后与通道内的信号序列的结合位点（受体）结合，其后的肽序列是以袢环的形式通过运输通道。不过N端的起始转移序列是可切除的序列，它的旁边有信号肽酶的作用位点，以N端信号序列作为起始转移信号的一般都是分泌蛋白。

 B）内部信号序列（internal signal sequence）与单次跨膜蛋白：内含信号序列又称内部信号肽（internal signal peptide）,它不位于N端，但具有信号序列的作用，故称为内部信号序列，它可作为蛋白质共翻译转移的信号被SRP识别，同时它也是起始转移信号，可插入蛋白质转运通道，并与通道中的受体结合，引导其后的多肽序列转运。

内部信号序列是不可切除的信号序列，这是与N-端信号序列的一个重要区别。由于内部信号序列是不可切除的，又是疏水性的，所以它是膜蛋白的一部分，如果共翻译转运蛋白质中只有一个内部信号序列，那么合成的蛋白质就是单次跨膜蛋白。内部信号序列中含较多正电荷一端始终保持朝向胞质溶胶一侧，这也决定了有的多肽链N-端在胞质溶胶一侧，C-端朝向腔内。有的则相反。(如图1-22)

C）终止转移肽（stop-transfer peptide）与单次跨膜蛋白：单次跨膜蛋白的形成除了与含有内部信号序列有关外，终止转移肽也与单次跨膜蛋白的形成有关。终止转移肽又称终止转运信号（stop-transfer peptide）,它是存在于新生肽中使肽链终止转移的一段序列，可导致蛋白质锚定在膜的双脂层中。因终止转移信号的作用而形成单次跨膜的蛋白质，那么该蛋白质在结构上只有一个终止转移序列，没有内部转移信号，但在N-端有一个信号序列作为起始转移信号。（如图1-21）

图1-20膜整合蛋白的不同类型（引自Lodish et.al 2004）

图1-21第一类整合膜蛋白合成示意图（引自Lodish et.al 2004）

D）二次跨膜蛋白与多次跨膜蛋白：他们的形成与内部信号序列与终止转移信号相关，如果是二次跨膜，则含有一个内部信号序列和一个终止转信号。因此，新生肽上是否含有终止转移信号决定了新生肽是否全部穿过内质网膜成为内质网腔中的可溶性蛋白还是成为膜蛋白。膜蛋白的跨膜此书是由其内部信号序列和终止转移信号序列的数目决定的，这些信号序列都是多肽链中疏水氨基酸区，因此，根据多肽链中疏水氨基酸区的数量和位置可以预测蛋白质的穿膜情况。另外，由于膜蛋白总是从胞质溶胶传入内质网膜，并且总是保持信号序列中含正电荷多的一端朝向胞质溶胶面，因而相同蛋白质在内质网膜中的取向也必然相同。结果造成内质网膜中蛋白质取向的不对称性，并由此决定了该蛋白质在其他膜结合细胞器的膜结构的方向。

图1-22第二类整合膜蛋白的合成模型（引自Lodish et.al 2004)

图1-23内部信号序列和终止转移肽（引自Lodish et.al 2004）

⑥Bip蛋白在ER蛋白质的转移和装配中的作用

Bip是重链结合蛋白（heavy-chain binding protein）的简称，因为它可以与IgG的重链结合。Bip是以类分子伴侣，属于Hsp70家族，在内质网中有两个作用：

A）Bip同进入内质网的未折叠蛋白质的疏水氨基酸结合，防止多肽链的不正确折叠和聚合。此过程消耗ATP。在多数情况下，释放出的多肽很快折叠或与别的亚基共同组装成完整的蛋白质。正确折叠或装配的蛋白质不会同Bip再结合，但是，如果蛋白质进行不正确的折叠或错误的装配，Bip会马上同这种蛋白质结合，使蛋白质处于未折叠状态，从而防止蛋白质的错误折叠。

B）防止新合成的蛋白质在转运过程中变形或断裂。通过重组DNA技术，将酵母中变码Bip蛋白的基因突变成温度敏感性后，当提高细胞培养温度时，Bip的功能就会丧失，导致蛋白质在ER中的聚集，抑制新生肽向ER的转移。

图1-24蛋白质后转移中Bip的作用（引自Lodish et.al 2004）

3、蛋白质在内质网和高尔基体中的糖基化

①在内质网中的修饰：新生肽进入ER腔之后除了要进行正确的折叠外，还要经过不同的修饰之后才能运送到其他的部位。A）N-糖基化：ER上合成的蛋白质大多数是糖蛋白（glycoprotein），是由糖和蛋白质共价连接形成的。糖是在蛋白质合成完成之前加上去的，是直接加到正在生长中的多肽链上。糖基化的第一步是将一个十四碳糖的核心寡聚糖添加到新形成多肽链的天冬酰胺上，其氨基酸的特征序列是Asn-X-Ser/Thr,天冬酰胺作为受体。

核心寡聚糖是由N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖和葡萄糖组成。这种寡聚糖同ER膜中的多萜醇磷酸（dolichol phosphate）紧紧相连。被转移到新生肽上的寡聚糖会进一步加工，主要是切除3分子葡萄糖和一分子甘露糖。磷酸多萜醇是长链醇，又称磷酸长醇。它具有很长的疏水尾部，可与膜紧紧结合。核心寡聚糖是结合在磷酸多萜醇的磷酸基上，当ER膜上有蛋白质合成时，整个糖链一起转运。

B）羟基化：新生肽的脯氨酸和赖氨酸进行羟基化（hydroxylation），形成羟脯氨酸和羟赖氨酸，不过这种反应只是在少数蛋白质上发生。在合成胶原的细胞里，是一个主要反应。

C）形成脂锚定蛋白：新合成的蛋白质除了成为跨膜蛋白外，还会通过酰基化同ER膜上的糖脂结合，将自己锚定在膜上。

②在高尔基体中的糖基化：高尔基体的蛋白质糖基化作用发生在高尔基体的各个特异的功能区室（functional compartments of Golgi apparatus）中进行的。动物细胞中的糖蛋白主要位于细胞质膜、溶酶体、分泌产物中。在内质网中合成的蛋白质大多以就地进行了糖基化，但需要进一步加工。

A）    高尔基体中的N-糖基化：有两种一是高甘露糖寡糖（high-mannose oligosaccharide）;一是复合寡糖(complex oligosaccharide)。前者含有N-乙酰葡萄糖胺和很多甘露糖；后者除了含N-乙酰葡萄糖胺外，还含有半乳糖、唾液酸和岩藻糖。对于进入高尔基体中的糖蛋白来说，形成高甘露糖基寡糖侧链所需要的修饰比较简单，只要切除3分子的甘露糖即可。而形成复合寡糖则比较复杂，要切除5分子甘露糖，加上2分子半乳糖、两分子唾液酸，有时还要加上岩藻糖。

B）高尔基体中的O-糖基化：是将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟基氧原子上。O-糖基化由不同的糖基转移酶催化，每次加上一个单糖。同复杂的N-糖基化一样，最后一步是加上唾液酸残基，这一反应发生在高尔基体外侧膜囊和TGN中。

图1-25糖基化过程

4、溶酶体酶蛋白的M6P标记及其分选途径

图1-26溶酶体蛋白的信号斑的作用（引自Lodish et.al2004）

图1-27甘露糖6-磷酸分选途径和溶酶体形成的主要过程（引自Lodish et.al2004）

①溶酶体蛋白的M6P标志和信号斑：溶酶体酶上都有一个特殊的标记：甘露糖6-磷酸（mannose 6-phosphate,M6P），这一标志是溶酶体酶合成后在糙面内质网和高尔基体通过糖基化和磷酸化加上去的。A）糖基化：溶酶体膜蛋白在膜旁核糖体上合成，通过信号台的引导进入糙面内质网，在糙面内质网上进行N-糖基化。在此过程中，溶酶体酶蛋白先带上3个葡萄糖、9个甘露糖和2个N-乙酰葡萄糖胺。然后切除3分子葡萄糖和1分子甘露糖后转运到高尔基体；B）磷酸化：在高尔基体内侧网络对N-连接的糖链进行磷酸化修饰，戴上甘露糖6-磷酸标志。信号斑（signal patch）:存在于完成折叠的蛋白质中，是由几段信号肽形成的一个三维结构，该三维结构成为蛋白分选的信号，被特异的蛋白质进一步识别从而指导蛋白质的转移与定位。溶酶体酶蛋白一级结构上通常有几段信号序列，在磷酸化时可形成信号斑。信号斑可同磷酸转移酶特异性结合。溶酶体酶的磷酸化由2种酶催化：第一种是N-乙酰葡萄糖胺磷酸转移酶（N-acetyglucosamine phosphotransferase），它有两个功能位点，一是识别位点，能够同溶酶体酶的信号斑进行特异性结合；另一是催化位点，进行磷酸的转移。第二种酶是N-乙酰葡萄糖苷酶，功能是切除N-乙酰葡萄糖胺。

反应中磷酸基的供体是UDP-N-乙酰葡萄糖胺，甘露糖残基磷酸化的位点是6位碳原子。每个溶酶体蛋白上有8个甘露糖残基，至少有一个被磷酸化，也会有多个甘露糖残基磷酸化的情况发生。

②溶酶体酶的甘露糖6-磷酸分选途径：A）M6P受体蛋白：是高尔基体外则网络上的膜整合蛋白，能够识别溶酶体水解酶上的M6P信号并与之结合，从而使溶酶体的酶蛋白分选出来，然后通过出芽的方式将溶酶体的酶蛋白装入分泌小泡。M6P受体蛋白同M6P的结合是高度特异的，并且具有较高的结合力，它在PH为6.7-7的条件下与M6P结合，而在酸性条件下（HP=6）脱落。M6P受体主要存在于高尔基体的外侧网络，但在一些动物细胞中的质膜中发现有很多M6P受体蛋白存在，这可能是细胞的一种保护机制，可防止溶酶体的酶不正确的分泌到细胞外。据估计有5%-10%的溶酶体酶是通过这种方式从细胞外送达细胞内。B）溶酶体形成的M6P分选途径的主要过程：首先形成具有网格蛋白外被的溶酶体小泡，即具有M6P标记的溶酶体酶在高尔基体外侧网膜与其上的M6P受体蛋白结合，在网格蛋白帮助下形成。然后，网格蛋白解聚，溶酶体酶分泌小泡与刺激内体融合，因为次级内体内部的PH约为5.5，融合后的内体中的PH低于6，因此，与M6P受体结合的溶酶体酶与受体脱离，释放到内体中。接着，由次级内体中的磷酸酶是溶酶体酶脱磷酸，防止溶酶体酶与M6P受体重新结合。融合后的次级内体可以通过出芽形成两种类型的小泡，一种含有溶酶体酶蛋白，不含有M6P受体，即为成熟溶酶体；另一种小泡只有M6P受体，不含有酶，这种小泡主要与外侧高尔基体融合，偶尔也会同质膜融合，完成M6P在循环。极少数分泌到细胞外的溶酶体酶与质膜中的M6P受体蛋白结合，并通过内吞作用被包装到初级内体中，然后通过来自外侧高尔基体的溶酶体酶运输小泡相同的方式形成成熟的溶酶体。

5、内体（endosome）：细胞内一种膜结合细胞器，分为初级内体和次级内体，初级内体（early endosome）：通常位于细胞质的外侧，次级内体常位于细胞质的内侧，靠近细胞核。内体的主要特征是酸性的、不含溶酶体酶的小囊泡，其内的受体与配体是分开的。一般认为初级内体是由于细胞的内吞作用而形成的含有内吞物质的膜结合的细胞器，通常是管状和小泡状的网络结构集合体。次级内体中PH呈酸性，具有分拣作用，能够分选结合物的受体，让它们再次循环到细胞质膜表面或高尔基体内侧网络，因次生内体中的受体和配体不再偶联在一起，所以次生内体又被称为CURL（compartment of uncoupling of receotor and ligand）,意思是受体和配体非偶联的区室。内体膜上有H+-ATPase，利用H+的浓度保证了内部酸性。