生物膜与内膜系统

生物膜是细胞结构的重要基础，大部分细胞器都是以生物膜为基础构建的，在高等真核生物的细胞内由膜分隔出许多不同的区室。由于膜很薄，无法用光学显微镜观察，直到20世纪50年代后期，由于制片和染色技术的发展，Duck大学的Robertson首次在电子显微镜下观察的细胞质膜的3层结构，后来发现无论是动物、植物还是微生物，无论是细胞质膜还是内膜系统都有着相同的超微结构。细胞膜和内膜系统两者统称生物膜。

1.1 概述

一、膜功能概述

1、界膜和区域化（delineation and compartmentalization）：膜是连续的、完整的，因而必然形成封闭的区域。质膜包裹整个细胞的所有内含物，而核膜、与细胞内膜在细胞内包裹不同的区域。细胞内各种膜结构具有不同的内含物，。细胞区域化使特异性活动的进行很少受到外界的干扰，同时能进行独立调节，使细胞的生命活动更加高效和有序。

2、调节运输（regulation of transport）：膜为两侧的分子交换提供一个屏障，一方面能够让某些物质进行“自由通透”，另一方面又作为某些物质出入细胞的屏障。膜对物质的运输具有选择性，有些物质在细胞内的浓度很高，有些物质只能沿浓度梯度进入细胞，需要通过特殊的运输机制来调节。

3、功能定位与组织化（localization and organization of function）：通过形成膜性细胞器，使细胞的功能定位在一定的细胞结构，并组成相互协作的系统。例内质网、高尔基体等膜性细胞器的基本功能是参与蛋白质的合成、加工和运输。

4、信号的检测与传递（detection and transmission of function）：在细胞对外界刺激作出应答反应的过程中，质膜起至关重要的作用，质膜中具有各种不同的受体，结合不同的信号分子即受体，进行信号传递，使细胞对外界刺激产生应答反应。

5、参与细胞间的相互作用（intercellular interaction）：在多细胞生物中，细胞通过质膜进行细胞间的相互作用，包括细胞识别、细胞黏着、细胞连接等。如动物细胞通过间隙连接，植物细胞通过胞间连丝进行相邻细胞间的通讯。

6、能量转换（energy transduction）：膜涉及一种形式的能量转化成另一种形式的能量的过程。最基本的能量转换发生在光合作用中，膜结合色素吸收太阳能，转化为化学能储存在糖中。膜也参与将糖类、脂肪中的能量转移到ATP中。真核细胞中，负责能量转换的装置位于叶绿体和线粒体膜上。

二、红细胞膜结构

红细胞（red blood cell,erythrocyte）是结构最简单的细胞，是研究膜结构的最好材料，对膜结构的认识许多来自对红细胞膜结构的研究。另外，由于衰老与膜成分的变化有极大的关系，所以红细胞又是研究衰老的最好材料。

1、红细胞的形态结构

（1）形态：成熟的红细胞呈双面凹陷或单面凹陷的盘状，直径约7.3-8.5µm，厚度1.7µm，体积8.3µm³，表面积为145µµm²，表面积与体积的币值较大，有利于细胞的变形、气体交换与携带。

（2）红细胞是研究膜结构的最好材料：①数量大，取材容易，并极少有其他的细胞污染。②成熟的哺乳动物的红细胞中没有细胞核和线粒体等膜相细胞器，细胞质膜是其唯一的膜结构，所以分离后不存在其他膜污染的问题。

2、红细胞功能

（1）携带肺吸进的氧运送到身体的其他组织：氧是一种小分子，能够自由扩散通过红细胞质膜进入红细胞内，并与血红蛋白结合。在肺毛细血管中由于O₂分压高，所以O₂很容易透过红细胞质膜进入红细胞。

（2）带走并呼出CO₂：在体组织毛细血管中，由于O₂的压力低，CO₂的压力高，因此O₂被释放，CO₂进入红细胞。进入红细胞的CO₂在碳酸酐酶的作用下，由不溶性的CO₂转变为可溶性的HCO₃^-，水溶性的碳酸氢根阴离子可通过红细胞质膜中的带3蛋白同Cl离子进行交换排出红细胞，所以将带3蛋白称为阴离子交换蛋白。

3、红细胞血影

血影（ghost）：是将分离的红细胞放入低渗溶液中，水渗入到红细胞内部，红细胞膨胀、破裂，从而释放出血红蛋白，所得到的红细胞质膜具有很大的变形性、柔韧性和可塑性，当红细胞的内容物渗漏之后、质膜可以重新封闭起来称为红细胞血影。

4、红细胞膜骨架

（1）红细胞膜骨架（erythrocyte membrane cytoskeleton）的概念：是存在于红细胞质膜内侧的一种特殊结构，是由膜蛋白和纤维蛋白组成的网架，参与维持细胞质膜的形状并协调质膜完成多种生理功能。

（2）红细胞膜蛋白的组成：通过单向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析红细胞膜蛋白，发现有15种主要的蛋白带，分子质量为15kDa到250kDa。其中有3种主要的蛋白，约占膜蛋白60%以上：①血影蛋白（spectrin）：又称收缩蛋白，位于红细胞膜下，不属于红细胞膜蛋白，是红细胞膜骨架的主要成分。是一种长的可伸缩的纤维蛋白，长约100nm，有两个亚基构成：α-亚基分子质量200kDa；β-亚基分子质量220kDa。两个亚基链为反平行排列，扭曲为麻花状，形成异二聚体。两个异二聚体头头连接形成200nm长的四聚体。②血型糖蛋白A（glycophorin A）：又称涎糖蛋白（sialo glycoprotein），富含唾液酸。属单次跨膜蛋白，由131个氨基酸构成，N端在外侧，结合16个低聚糖侧链。除A型外，血型糖蛋白还有B、C、D型，血型糖蛋白的基本功能可能是在它的唾液酸中含有大量的负电荷，防止红细胞在循环过程中相互聚集沉积在血管中。③带3蛋白（band 3 protein）：属红细胞膜蛋白，在PAGE电泳中位于第3条带而得名。带3蛋白在红细胞膜中含量很高，约为红细胞膜蛋白的25%。是由两个相同的亚基组成的二聚体，每条亚基含有929个氨基酸，是一种糖蛋白，跨膜12-14次，为多次跨膜蛋白。具阴离子转运功能，被称为阴离子通道。

除上述3种蛋白外，红细胞膜蛋白还包括：肌动蛋白（actin）：又称带5蛋白，是细胞骨架的主要成份，肌动蛋白纤维链长约35nm，其中含13个肌动蛋白单体和一个长35nm的原肌球蛋白分子。肌动蛋白纤维上有多个与血影蛋白结合的位点，通过与血影蛋白游离端的结合参与膜骨架结构的形成；锚定蛋白（ankyrin）：又称带2.1蛋白，是一种比较大的细胞内连接蛋白，每个红细胞约含10万个锚定蛋白，相对分子量为215000。锚蛋白一方面与血影蛋白相连，另一方面与跨膜的带3蛋白的细胞质结构域部分相连，因此，锚蛋白借助带3蛋白将血影蛋白连接到细胞质膜上，也就将骨架固定到质膜上；带4.1蛋白（band 4.1 protein）：是由两个亚基组成的球形蛋白，它在膜骨架中的作用是通过与血影蛋白结合，促使血影蛋白与肌动蛋白结合。因为没有肌动蛋白结合位点，故其本身不与肌动蛋白结合；内收蛋白（adducin）：是由两个亚基组成的二聚体，每个红细胞有30000个分子。其形态为不规则的盘状物，高5.4nm，直径12.4nm。内收蛋白可与肌动蛋白及血影蛋白的复合体结合，并且通过Ca2+和钙调蛋白的作用影响股价蛋白的稳定性，从而影响红细胞的形态。

（3）红细胞膜骨架的形成：一般认为膜骨架蛋白主要包括：血影蛋白、肌动蛋白、原肌球蛋白、锚定蛋白、带4.1蛋白、内收蛋白等红细胞膜细胞质面的外周蛋白。红细胞膜骨架的网状支架的形成及于膜的结合过程可分为3步：①血影蛋白与带4.1蛋白、肌动蛋白的相互作用：血影蛋白的首先形成α-、β-二聚体，在红细胞膜内进一步形成四聚体，在带4.1蛋白的帮助下同肌动蛋白寡聚体结合组成骨架的基本网络。②带4.1蛋白与血型糖蛋白作用：带4.1蛋白的N端30kDa区在生理状态下带正电荷，而血型糖蛋白带负电荷，所以带4.1蛋白能够以静电稳定性同血型糖蛋白结合。③锚定蛋白与血影蛋白、带3蛋白的相互作用：锚定蛋白N端90kDa区可与带3蛋白结合，而72kDa区可与血影蛋白结合，由于带3蛋白是膜整合蛋白、血影蛋白是膜骨架蛋白，所以锚定蛋白起媒介作用将骨架蛋白与质膜相连。

1.2膜的化学组成

一、膜脂（membrane lipid）

1、膜脂的主要类型：膜脂是生物膜的基本组成成分，约占膜的50%，主要有3大类。

(1)磷脂（phospholipid）：是含有磷酸基团的脂，细胞膜中含量最丰富和最具特性的脂。是膜脂的基本成分，约占膜脂的50%以上。动、植物细胞膜上都有磷脂。①磷脂的类别：甘油醇磷脂；鞘磷脂。甘油磷脂包括磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰肌醇等。②磷脂的组成：甘油（1分子）、脂肪酸（2分子）、磷酸（1分子）、氮碱（1分子）。③分子结构特点：头部基团（head group）:由带负电的磷酸基团结合氮碱基构成，例胆碱、乙醇胺、丝氨酸、肌醇。也称极性头部，其大小、形状、电荷的不同与磷脂-蛋白质的相互作用有关；尾部：由两条长短不一的烃链构成，为非极性的，疏水区。一般含有14-24个偶数碳原子，其中一条烃链常含有一个或数个双键，双键的存在可使这条链有一定的弯曲。烃链的长度和饱和度的不同可以影响磷脂的相互位置，进而影响膜的流动性。

（2）鞘脂（sphingolipid）：在膜中的含量较少。①组成：含1分子鞘氨醇（sphingosine，一种含长的碳氢链的氨基醇），1分子脂肪酸与鞘氨醇的氨基以酰胺键相连，形成神经酰胺，鞘氨醇的羟基上可以连有不同的基团，一般连接糖类形成鞘脂，也称糖脂（glycolipid）。②分子结构特点：含1个极性头部，2个非极性尾部，即具有双亲媒性，与磷脂相似。

（3）固醇类：主要为胆固醇（cholesterol），存在于真核细胞的膜中。动物细胞膜中胆固醇含量较高，有的占膜质的50%，大多数植物细胞、细菌细胞质膜中不含胆固醇，胶木细胞膜中含的是麦角固醇。胆固醇的分子结构特点：①极性头部：羟基基团构成。②非极性尾部：由类固醇环和1个非极性的碳氢链构成。③胆固醇分子比其他膜脂要小，双亲媒性较低。④胆固醇分子是扁平和环状的，对磷脂的脂肪酸尾部的运动具有干扰作用，所以胆固醇对调节膜的流动性、加强膜的稳定性有重要作用。

图1-1 甘油磷脂（引自David L.Naison et.al,4#th）

图1-2 脂酰磷脂和鞘磷脂（引自David L.Naison et.al,4#th）

图1-3鞘脂（引自David L.Naison et.al,4#th）

 图1-4固醇（引自David L.Naison et.al）

2、膜脂的特性和功能：

（1）特性：①多样性：不同类型的膜含有不同类型的脂，并赋予膜不同的特性，产生膜结构的多样性。②双亲性：膜脂都是两性物质，都具有亲水的极性头部和疏水的非极性尾部。③脂双层具有伸缩性：使得细胞在运动和分裂时膜得以形变、解体和重建。同时，脂的双层性和可塑性也有利于细胞的融合和生殖，如在受精中，精细胞与卵细胞的结合与局部融合，就需要膜发生变化。

脂                  存在的膜                           功能

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主要磷脂

  磷脂酰胆碱            存在于大多数膜中                形成脂双层，起界膜的作用

  磷脂酰乙醇胺          存在于大多数膜中                ，防止水溶性物质的自由

 磷脂酰丝氨酸           存在于大多数膜中                扩散

次要磷脂

  心磷脂                线粒体内膜                      激活染色体

  磷脂酰肌醇（PI）      存在于大多数膜                  作为三磷酸肌醇的供体

  鞘脂            大多数哺乳动物的细胞，特别是神经细胞  屏障作用，激活某些酶

  糖脂                  叶绿体类囊体膜                  屏障作用

  胆固醇                大多数动物细胞膜                降低膜的渗透性，调节膜的

                                                        流动性

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3、脂质体（liposome）

(1)为脂类的又一重要特性，也称自组装（self assemble）,即脂类在水中能够自我装配成脂双层结构。

图1-5脂质体的类型（引自David L.Naison et.al,4#th）

(2)脂质体被证明在生物膜研究中有重要意义：①将膜蛋白插入脂质体中，可以在比天然生物膜更简单的环境中研究他们的功能。②将脂质体作为体内药物和DNA的运载体。药物或DNA分子能够连接到脂质体的膜上或以高浓度的形式包含在腔内。所构建的脂质体膜中含有特殊的蛋白质（抗体或激素），可以使脂质体选择性地结合到特异的靶细胞表面将药物或DNA运送到目的地。③隐性脂质体（stealth liposome）：是包被了合成的多聚物外衣的脂质体，可防止免疫系统破坏。如治疗卡帕斯肿瘤（Kaposiˊsacroma）的含阿霉素（doxorubicin）的隐性脂质体已经使用。

图1-6脂成分对脂片层厚度和弯曲的作用（引自Lodish et.al 2004）

二、膜糖（membrane carbohydrate）

膜中的糖约占膜重量的2-10%，膜糖的含量依不同细胞而有所不同。例红细胞的质膜蛋白质占52%、脂类占40%、糖类为8%。质膜上90%的糖类以共价键与蛋白质连接成糖蛋白，剩余的糖类共价连接到脂分子上形成糖脂。特别指出的是：细胞质膜上的所有膜糖都位于质膜的外表面，而细胞内膜上的糖链也是背向细胞质一侧，位于内表面。

1、膜糖的种类

自然界存在的单糖及其衍生物有200余种，存在于膜中的糖类只有9种，动物细胞膜中主要7种：（1）D-葡萄糖（D-glucose）（2）D-半乳糖（D-galactose)（3）D-甘露糖（D-mannose）（4）L-岩藻糖（L-fucose）（5）N-乙酰-D-半乳糖胺（N-acetyl-D-galactosamine）（6）N-乙酰葡萄糖胺（N-acctyl-glucosamine）（7）唾液酸（sialic acid）。

2、膜糖的存在方式

真核细胞中膜糖以共价键形式与膜脂或膜蛋白相连，即以糖脂或糖蛋白的形式存在。糖与氨基酸是以糖苷键进行连接的，包括N-糖苷键、O-糖苷键，N-连接主要是糖与天冬酰胺连接，较普遍，糖链一般有10个以上糖基；O-连接主要是糖与丝氨酸或苏氨酸连接，连接糖链较短，一般为4个糖基。

图1-7糖与蛋白的连接方式（引自David L.Naison et.al,4#th）

糖蛋白是细胞膜中最为丰富的蛋白质，真核细胞膜上的蛋白质几乎都是糖蛋白。糖蛋白主要存在于细胞质膜上，内膜中糖蛋白极少。在动物细胞中，糖蛋白是糖萼的主要成分，而在植物细胞中主要是由糖脂构成膜包被。内膜系统中的内质网和高尔基体是糖蛋白和糖脂的合成场所。

3、膜糖的功能

（1）提高膜的稳定性，增强膜蛋白对细胞外基质中蛋白酶的抗性，帮助膜蛋白进行正确的折叠和维持正确的三维构型。

（2）参与细胞的信号识别、细胞的黏着。如同某些糖脂一样，莫蛋白中的糖基是细菌和病毒感染时的识别和结合位点。

（3）糖蛋白中的糖基还帮助新合成蛋白质进行正确的运输和定位。如溶酶体的酶蛋白都有一个6-磷酸甘露糖的标记这样容易被识别和被分选装入溶酶体小泡。

（4）对糖脂的功能目前了解的不多，直到最多的是红细胞质膜中糖脂对ABO血型的决定作用。

ABO血型决定子（determinant）：即ABO血型抗原，是一种糖脂，其寡糖部分具有决定抗原特异性的作用。ABO决定子是短的、分支寡糖链，A血型的人具有一种酶，这种酶能够将N-乙酰半乳糖胺添加到糖链的末端；B血型的人具有在糖链末端添加半乳糖的酶，AB血型的人具有上述两种酶；O血型的人则缺少上述两种酶，在抗原的末端即无N-乙酰半乳糖胺，又无半乳糖。

凝集素（lectin）：是一类能与糖类特异结合的蛋白质，能使细胞发生凝集。最初在植物种子中发现，有些有剧毒，因而对种子有保护作用。有些凝集素存在于细胞表面，参与细胞间识别。由于凝集素能与细胞表面的糖蛋白、蛋白多糖、糖脂结合，而且比同凝集素识别糖基的不同特异序列，发生特异性结合，因此，在细胞生物学中被广泛用于定位和分离各种含糖的细胞膜分子。

图1-8糖与脂或蛋白质的连接（引自Lodish et.al 2004）

三、膜蛋白（membrane protein）

图1-9膜蛋白的类型（引自David L.Naison et.al,4#th）

1、膜蛋白的分类

膜蛋白根据与脂双层关系分为3类

（1）整合蛋白（integral）：穿过脂双层。基本为跨膜蛋白（transmembrane protein），具有突出于胞外和胞质两侧的结构域。含单次跨膜蛋白；多次跨膜蛋白。

特点：为兼性分子，兼有亲水和疏水部分。

去垢剂：用于从膜上分离蛋白质，进一步对整合膜蛋白进行结构性质研究。分两种：一是离子型的，常见为SDS（使蛋白质变性）；另一是非离子型的，常见为TritonX-100（通常不会改变蛋白质的三级结构）。和膜脂一样，去垢剂也是兼性的，由一个极性末端和一个非极性碳氢链构成。去垢剂能够代替磷脂稳定整合蛋白而使它们在水溶液中呈可溶状态。

与膜脂的连接：为非共价连接。跨膜区为疏水连接；胞外和胞质两侧的结构域为离子作用力。

（2）外周蛋白（peripheral protein）：完全位于脂双层之外，分布在胞质侧或胞外侧。

通过弱的静电作用与膜脂的亲水性头部基团或从脂双层伸出的整合蛋白亲水部分相连，使之结合在膜上。可以用水溶性的盐溶液抽提溶解。

（3）脂锚定蛋白（lipid-anchored protein）：位于脂双层之外，在膜外侧或胞质侧，与相连的脂分子呈共价连接。根据脂锚定的类型和它们所在的生物膜表面，分为两类：一类为GPI锚定蛋白，处于质膜外表面，通过与甘油磷脂酰肌醇（GPI）分子连接的寡糖链结合到膜上，GPI包埋在脂双层外小叶中。一种罕见的贫血病（间歇性夜间血红蛋白尿），因为GPI的合成缺陷，导致红细胞容易裂解；另一类位于质膜胞质一侧，通过长长的包埋在脂双层内小叶中的碳氢链锚定在膜上。至少有两类以这种方式结合到质膜上的蛋白质（Src和Ras），涉及正常细胞的恶性转化。

1.3膜的分子结构及特性

一、结构模型

1、流动镶嵌模型（fluid mosaic model）：1972年Singer和Nicolson提出，认为脂类双分子层是膜的“构架”，球蛋白分子有的镶嵌在脂双层的表面，有的则部分或全部嵌入其内，有的横跨脂双层。此模型强调膜的流动性和不对称性。

图1-10流动镶嵌模型（引自David L.Naison et.al,4#th）

2、脂筏模型（lipid rafts model）：脂筏是指膜脂双层内含有特殊脂质的微区，并载着特殊的蛋白质，微区内陷可形成囊泡；脂筏与细胞骨架蛋白交联。

二、膜的特性

1、膜的流动性：包括膜脂的流动性（fluidity）和膜蛋白的运动性（mobility）。膜的流动性概念是指膜内部的脂和蛋白质分子的运动性。膜的流动性不仅是膜的基本特征之一，也是细胞进行生命活动的必要条件。

膜的流动性主要是由膜脂双层的状态变化引起的。在生理条件下，膜脂多呈液晶态，温度下降至某点。则变为晶态。一定温度下，晶态又可变回液晶态。这种临界温度称为相变温度。在不同温度下发生的膜脂状态的改变称相变（phase transition）。

图1-11脂筏模型示构成脂筏微区的脂与锚定蛋白（引自Lodish et.al 2004）

图1-12脂筏模型（引自David L.Naison et.al,4#th）

膜脂由于成分不同而各有其不同的相变温度。在某一温度下，有些脂处于晶态，另一些仍处于液态。处于两种不同状态的磷脂分子分别各自汇集，形成了相的分离，从而形成一些流动性不一的微区（domain）。由于膜脂的流动性，给膜蛋白提供了可以流动的环境，加上膜蛋白自身的构型变化，使膜蛋白处于动态之中。

（1）膜脂的运动：脂的流动是造成膜流动的主要因素，膜脂的运动方式主要有3种①侧向扩散（lateral diffusion）：又称侧向迁移，指同一单脂层内脂分子的互相换位，速度相当快，有人推测细菌质膜中磷脂以这种方式从细胞的一端扩散到另一端只需1-2s。②旋转运动（rotation）：指每个脂分子围绕其长轴做快速旋转。③翻转扩散（transverse diffusion）：又称为翻转（flip-flop），指脂分子从脂双层的一个层面翻转至另一个层面的运动。磷脂发生翻转运动时，磷脂的亲水头部基团必须克服内部疏水区的阻力，这在热力学上是不利的。但有些细胞含有翻转酶（flppase）催化之一过程的完成，因此这些酶在维持膜脂的不对称分布中起重要作用。

膜脂还可以弯曲（flexion），即膜脂围绕着与膜平面相垂直的轴进行伸缩摆动。

图1-14膜脂运动（引自David L.Naison et.al,4#th）

（2）膜蛋白的运动：由于膜蛋白的分子量较大，它不可能像膜脂一样运动。利用现代分子生物学技术和摄像技术观察，发现所研究的蛋白不同运动方式不同。包括①随机移动，指有些蛋白质可以在整个膜上随机移动，移动速率比用人工脂双层测得的要低。②定向移动，有些蛋白质比较特殊，在膜中作定向移动。如某些膜蛋白可以在膜上从细胞的一端移向另一端。③局部扩散，有些蛋白虽然能够在膜上作自由扩散，但只能在局部范围内作旋转扩散和侧向扩散。

（3）膜流动性的生理意义：脂双层的物理状态对膜的生物学性质有很大影响。如果膜是一种有序、刚性结构则无法运动；而一个完全液态，毫无粘性的膜又会造成膜成分没有取向、无法组织成结构，同时也不能提供机械支持，而膜的流动性在两者之间达到了完美的统一。膜的流动有利于某些结构的形成，完成许多最基本的细胞过程。①提高膜中某些酶的活性，如卵磷脂-胆固醇转酰基酶的活性与膜的流动性密切相关，膜流动性大，有利于酶的侧向扩散和旋转运动，酶活性提高。②许多最基本的细胞过程，包括细胞运动、细胞生长、细胞分裂、形成细胞间连接、分泌以及内吞作用，都取决于膜组分的运动。另外膜的流动性与发育和衰老过程都有相当大的关系，例成年鼠的脂肪细胞膜与幼年鼠的相比，磷脂的饱和脂肪酸含量较高，流动性较低。