细胞培养污染的检验与去除
1.细菌与霉菌的污染
由于环境条件差和操作不当等原因，常可发生细菌和霉菌的污染。常见污染的细菌
有革兰阴性菌如：大肠埃希菌、枯草杆菌、假单胞菌等；革兰阳性菌有葡萄球菌等，真
菌污染常可发生，尤其炎热、潮湿的季节十分常见，如烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子
苗等。霉菌和细菌生长迅速，能在短时间内抑制
细胞生长，或产生有意物质杀死
细胞。
镜下可见脑浆内出现大量颗粒，
细胞变圆或崩溃，从瓶壁脱落。霉菌污染容易发现，大
多形成白色或浅黄色菌团漂浮于培养液表面，肉眼可见，有的散在生长，镜下可见丝状
菌丝，纵横交错于
细胞之间。细菌污染如果较严重时培养基上清混浊，较轻时镜下可见
小的菌体在
细胞间运动，同时可涂片染色镜检或进行细菌培养基培养，加以确定。
抗生素及抗霉菌制剂对预防或排除细菌、霉苗污染均有效。工作中要特别注意和防
止所用培养液和血清的污染，日前应仔细检查有无混浊和菌丝存在，以防止在培养
细胞 时造成污染。
2.支原体污染的检测与去除
2.1 支原体的检测
2.1.1 PCR 法
2.1.1.1 原理 该法是通过PCR 技术将支原体16s rRNA 基因特异性扩增，来检测培养
细胞中污染的支原体。PCR 引物选自16s rRNA 基因上的支原体特异片段，此片段与其他细菌的序列无交叉性杂交反应。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳，经溴乙啶（EB）染色后在紫外透射仪上进行检测。
*16s r DNA 引物用水稀释至40μmol/L。
（1）正向引物：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3’
（2）反向引物：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3’
*质粒pBR322 引物用水稀释至40μmol/L.
（1）正向引物：5’-CATCTCGGGCAGCGTTGGGT-3’
（2）反向引物：5’-AGCGCAAGCGGAGTCAGTGAGC-3’
*裂解缓冲液：10mmol/L Tris-HCL(pH8.3)，50mmol/L KCL，2.5mmol/L MgCl2，5g/L Tween20
和5g/L TritonX-100。
*蛋白酶K（proteinase K）贮存液：蛋白酶K 20 mg/mL 溶于50%甘油中，于－20℃贮存。
*耐热DNA 聚合酶（如Taq 聚合酶）与相应的10×TAE 缓冲液
*琼脂糖（分子生物学级）；EB（10mg/mL 溶于水中并避光保存）。
*6×加样染液（40%甘油、0.125% 溴酚蓝和125mmol/L EDTA）.
*DNA 分子量标志（50ng/mL）、pBR322 DNA。
*PCR 仪、台式离心机、微波炉、电泳装置、紫外透射仪（UV）、加样枪、PCR 管（0.5mL
或0.2mL）。
2.1.1.2 方法与步骤
1）样品制备
（1）将106
细胞悬液或贴壁
细胞刮下来的悬液放1.5mL 微离心管内，以最大转速离心15min。
（2）弃去上清，将
细胞再悬浮于100μl 裂解液中，然后加蛋白酶K，使终浓度为60μg/mL。
（3）置微波炉内60℃孵育1h，然后升至95℃ 10min，再将样品置室温中降温。
2）PCR 扩增
（1）在冰浴中对各样品制备PCR 重要混合物，对每个样品均加入：
10×PCR 缓冲液 5.0 mL
25mmol/L dNTPs 混合物 0.4μl
40μmol/L 16sr DNA 引物 每种引物1.0μl
40μmol/L pBR322 DNA 引物 每种 2.0μl
pBR322 DNA 1pg/mL 2.0μl
DNA 聚合酶（5U/mL） 0.2μl
三蒸水 35.4μl
总量 45μl
（2）用无菌去离子水稀释样品为1:10，1:100。
（3）于每个eppendorf 管中加45μl PCR 扩增混合物，每管中分别加入样品原液及1:10，1:100 稀释液各5μl，操作均在冰浴中进行。
（4）在每个eppendorf 管中轻轻加入50μl 无菌矿物油，覆盖在液面上。如DNA 扩增仪带有有制式热盖，此步骤可省略。
（5）将各管放入DNA 扩增仪的孔槽内，并执行以下循环指令：
95℃ 10min 一个循环；
95℃，30S → 58℃ 1min → 72℃ 1min，共30 个循环；
最后72℃ 10min 延长循环。
3）PCR 产物分析
（1）制备含有EB 染料（0.1μg/mL）的1%琼脂糖凝胶（用TAE 缓冲液制备）
（2）从PCR 扩增仪中取出样品管，取10μlPCR 扩增产物加到2μl 带有染液的加样液中，混匀后加样到琼脂糖凝胶加样孔中，同时在对照孔中加10μl 标准DNA 分子量标志。
（3）凝胶置TAE 缓冲液中，电压80V，电泳 60-90min。
（4）凝胶电泳完毕，将凝胶置紫外透射仪下观察，有无被EB 染料着色的红色荧光DNA 条
带，样品孔与标准DNA 孔进行比较并拍照。
2.1.1.3 质控与提示
1）阳性对照
（1）如果支原体DNA 可查到，则10ngDNA 即呈阳性结果。
（2）如得到已知支原体感染的
细胞培养，
细胞可同样品一样处理，作为阳性对照，处理的
2）阴性对照
（1）用45μl PCR 扩增液加5μl 无菌去离子水混匀，作为阴性对照。
（2）在含45μl PCR 扩增液的eppendorf 管中建立一个对照孔，以2μl 无菌去离子水替代
pBR322 DNA（1pg/mL）。
（3）有时样品中可能含有聚合酶的抑制物，可阻抑PCR 扩增，这种情况很易被pBR322 扩
增片段的缺失所识别。遇此情况是，应从同一培养物中另取少量
细胞（105 个）重新制备一
份样品，如果这样做仍无扩增片段出现，就将
细胞在无抗生素的培养基中试生长2-3 周，然后再作支原体检测。因为抗生素能结合双链DNA，故有人怀疑抗生素具有抑制Taq 聚合酶的活性。
2.1.2 DNA 荧光染色法
2.1.2.1 原理
DNA 荧光染色法是以Hoechst 或4 ／ -6- 二氨基-2 苯基吲哚（ 4 ／
-6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）试剂为荧光染料，使支原体DNA 着色，用荧光显微镜
在感染的靶
细胞的胞质中辩认出荧光，证明试验样品中存有支原体。
2.1.2.2 试剂与仪器
*靶
细胞 CKI－1（IFO5003，JCRB0008）或Vero
细胞（ATCC CCL82）
*支原体 mycoplasma hyorhinis (ATCC 29052) M.orale(IFO 14477)
*培养液 MEM＋10％FBS（无抗生素）无钙镁 PBS 固定液；甲醇∶醋酸为3∶1
*荧光染液
①浓缩染液：100mLPBS 中加Hoechst Dye 5mg 防腐剂 thimerosal 10mg 用磁力搅拌器助溶
30min，每瓶分装1mL，严格避光保存于－20℃冰箱内
②使用液：将冻存的浓缩液取0.15mL加入100mLPBS中，（最终浓度为0.075μg/mL的Hoechst Dye 0.15μg/mL 的thomerosal 防腐剂）用磁力搅拌器搅拌助溶30min，使色素完全溶解。（使用前调制）
*荧光显微镜、各种吸管、60mm 玻璃平皿、10mL 离心管、4 个带有可活动玻片的培养皿、
盖玻片（无荧光）
2.1.2.3 方法与步骤
（1）检验材料的制备
①检体
细胞的培养：被检
细胞在不含有抗生素的培养中传代培养3 次以上（不低于3 次）在最后一次传代培养增殖期中换新鲜培养液，经2－3 天培养。
②
细胞回收：培养
细胞上清液，以及用橡胶刮匙从培养皿上刮上的
细胞，吸入离心管内，于
4℃下，1200r/min，离心10min。吸弃上清，留下约含106 个及大约1mL 上清液。
③冻融：将离心
细胞收集到冻存管内置－20℃冻结，30min 后置37℃孵箱内融解，如此反
复操作2 次，于4 1200r/min ℃ 离心10min，吸取上清液作为检体。
①将液氮（－196℃）冻存的CKI－1 或Vero
细胞解冻（37 1 ℃ 分钟内迅速解冻）计数活
细胞达2－3×103／mL，植入4 个带有可活动的切片在皿底的培养皿中，每培养皿1mL，置CO2 孵箱内培养。
②孵育24h 后在显微镜下见
细胞呈适当的密度（高倍镜下见160－240 个
细胞／视野）时，
弃去培养液，于每个带可活动切片平皿内换新鲜培养液0.9mL，在i 号皿内接种冻融检体
0.1mL 在ii 号皿内加0.1mL 培养液，作为阴性对照，iii 与iv 号皿内加入100cfu/0.1mL 的
M.hyorhinis 和M.orale 支原体液，作为阳性对照。将4 个培养皿置CO2 孵箱内培养6 天。
①吸弃培养液，用CMF－PBS 洗涤
细胞加在可活动玻片上1mL 固定液，固定10min。
②吸弃固定液，风干后各加染色液，置室温染色30min。
③吸弃染色液，用蒸馏水洗3 次，取下可活动玻片的杠架和垫圈，取下可活动玻片。
④滴入封片液，其上复上盖玻片并赶除气泡和多余的封片液，四周用封片胶封闭。
⑤启动紫外系统，用荧光显微镜观察（放大约×400－600 适宜）
（4）结果判定
①在
细胞质中观察有无荧光，试验样品与阳性、阴性对照对应观察。
②计数1000 个
细胞，有5 个以上的
细胞质中见荧光着色，可判定为阳性。
2.1.2.4 质控与提示
（1）标记的靶
细胞除CKI－1 和vero
细胞外，3T6
细胞（ARCCCCL96）也可使用。本法成功的要点之一是用作靶
细胞质控的管理应严格，必预先确认该
细胞无支原体的污染才能冻存使用。
（2）要明确本检体的结果判定，必须使用不含抗生素的培养液。
（3）染色液：Hoechst 染液不稳定，故每次检测前须新鲜配制，使用DAPI 也可以，均应新鲜配制。
（4）试验检体：被试
细胞回收时用橡胶刮匙刮下，不能用胰蛋白酶等水解酶类消化，制备
（5）阳性对照：本试验采用支原体M.hyorhinis 和M.orale 为阳性对照，要十分注意避免有新的污染源。
（6）特异性与敏感性：本法不是支原体的特异性检出法，对DNA 进行染色观察，对其他
微生物（
细胞内寄生的霉菌、细菌等）的污染，也可看出同样的荧光染色，甚至检体会含有
细胞的DNA 颗粒，都是引起结果判定混乱的原因。但
细胞培养所污染的支原体，M.hyorhinis、M.orale、M.salivariμm、M.hominis、M.fermentans 等约占支原体污染的97％，本法针对这些支原体污染的检出敏感度为1cfu，而一般污染
细胞中的支原体浓度为103－108cfu/mL，故本法仍具有很好的实用性。
2.2 支原体的去除
由于支原体对
细胞培养的交叉污染严重并在无意识之中发生，故对支原体检测为阳性的
细胞株应丢弃；只对某些贵重的
细胞株而言，才设法去除支原体。常用方法有药物法、免疫
法、稀释法、加热法等。从感染的
细胞系中去除支原体较简单的方法是用阻碍支原体DNA
或RNA 合成的抗支原体类抗生素处理
细胞。普遍的抗生素在
细胞培养液中对支原体是无效
的。而用于去除支原体的药物均为喹诺酮类和/或四环素类抗生素的衍生物。
2.2.1 试剂与仪器
*抗支原体药物：四环素与截短侧耳素的复合物（BM-cyclin）；卡那霉素、二甲胺四环素与
胼胝素协同使用，氟代喹诺酮类抗生素等，已有成品供应。
*金属通风橱、CO2 孵箱、离心机等
2.2.2 方法与步骤
（1）支原体污染的
细胞以105 个
细胞/mL（25cm2 培养瓶中约10mL）接种于常规培养基并加有抗支原体药物，药物浓度为理论（想）值IC50。， 即采用5~10 倍于常用量的冲击法。
（2）培养48h 后，去除培养液，恢复原先处理，并在1 周内重复同样的处理。
（4）常规培养2 周后，用前法所述检测
细胞有无支原体污染，如果无支原体检出，则重复
实验。2 至3 周后再次检测以确定该结果，经这样处理的
细胞认为是无支原体污染的。
2.免疫法
要用抗支原体抗体或人及动物血清中的补体与污染
细胞株于体外培养。支原体结合并裂
解破坏支原体。或用动物接种法将污染支原体的肿瘤
细胞接种于同种系动物皮下或腹腔，或
接种于裸鼠腹腔，利用动物体内免疫系统杀伤支原体。
3.克隆法
克隆法即有限稀释法。将污染支原体的
细胞进行有限稀释，接种于96 孔培养板，使之
每孔只接种一个
细胞，进行克隆培养，经前法检测，挑取无支原体污染的
细胞克隆，这种方
4.加热除去
根据支原体对热耐受性较差的特点，将受支原体污染的
细胞置于41℃中作用5~10h，最
长可达18h，以杀灭支原体，但41℃对培养
细胞本身也有伤害，故在处理前应欲试验摸好条
件。另外有人利用软琼脂技术，经50℃加热（4~6min）灭活污染
细胞的支原体，再于37℃
培养1~3 天，使琼脂中抗生素与支原体进一步作用，使热灭活的支原体彻底被清除。
3.内毒素污染的检测与去除
3.1 内毒素含量测定
3.1.1 原理 本法应用鲎变形
细胞溶解物（limμlus amoebocyte lysate，LAL）LAL 来检测和
／或定量革兰氏阴性细菌的内毒素，称鲎试验，鲎试验的机制是内毒素活化LAL 中前凝固
酶而使凝固蛋白原变不凝固蛋白，使LAL 出现肉眼可见的凝胶从而可定量测知内毒素的含
量。
3.1.2 试剂和材料
*待测样品
*用λ 表示鲎试剂的敏感性单位（例如，λ＝0.125EU／mL）(有商业成品)
●对照标准内毒素（CSE）（有商业成品）
●不含内毒素的水（即LAL 水）（有商业成品）
*硼硅酸盐制，锥形终末反应试管（内径10mm，长75mm）(内毒素测定专用，有商业成品)
*不含内毒素的氢氧化钠（0.1mol/L）
*不含内毒素的盐酸（0.1 mol/L）
*末被内毒素污染的硼硅酸玻璃制成的稀释用试管。
*指示温度计
*37±1℃恒温水浴箱。
*200 和1000μl 的微量移液管有未被内毒素污染的管头。
*无内毒素吸管（10、5、2 和1mL）
*PH 计或PH 试纸
*螺旋搅拌器
*能够保持250 1 ℃ 小时的干烤箱。
*聚膜（parafilm）
3.1.3 方法与步骤
测定内毒素水平需要进行两步（1）确定LAL 试剂的敏感度（2）检测待测样品中是否
存在可能导致假阴性结果的干扰因素。
1.确证鲎试剂的敏感度
（1）根据CSE 的初浓度，用LAL 水将CSE 连续二倍比稀释，稀释后的浓度为2λ，1λ，0.5λ，
0.25λ（例如，如果λ＝0.125EU／mL，则浓度分别为0.25，0.125，0.0625 和0.0312EU/mL）
(稀释管的体积是0.1mL)
（2）将各0.1mLCSE 稀释液转移到锥形末反应管中，然后向各管中加入0.1mL 的LAL 试
剂。
（3）用封口膜封闭管口并轻轻混匀。
（4）37±1℃下孵育60 分钟，轻柔地倒置试管（180°），不要振荡，观察结果。
当内容物形成坚实的凝胶，倒置试管后，凝胶仍然附着在管底，该结果为阳性。在每组
稀释液中，具有最低稀释浓度的CSE 稀释液应呈阴性结果，如果均呈阳性结果，应提高稀
释倍数，再进行试验。
（5）测定的终点是每组稀释液中最后出现阳性结果的稀释液的浓度。
GEP＝10m，m=∑e/f，其中e 为各组稀释液的终点的log 值的总和，f 为稀释液的组数。
如果计算出的GEP 介于0.5λ 与2λ 之间，可确证鲎试剂的敏感度。
2.对干扰因素的检测
（1）用待测样品将CSE 稀释成上述终浓度。
（2）测定混合液的pH 值，并用不含内毒素的NaOH 或HCL 将该混合液的pH 值调至6.5-7.5。
（3）重复上述测定GEP 的发骤，计算GEP 值。如果GEP 值介于0.5λ 和2λ 之间，则样品中不包含干扰因素。否则，提高样品的稀释倍数，重复测定。
3.对样品的定量测定
（1）A：准备两试管，分别盛浓度为2λ 和0.5λ 的CSE。(0.1mL，用LAL 水二倍比稀释)
B：用LAL 水将样品稀释，准备两组样品稀释液。(终体积为0.1m1，二倍比稀释)
C：用LAL 水作为阴性对照。(0.1m1)
D：向样品中加入CSE 至CSE 浓度为2λ，以此作为指示样品中是否含有
（2）干扰因素的对照(0.1m1)
重复前述步骤，向各管中加入0．1m1 的LAL 试剂。
（3）如果实验有效，则必须：
①呈阴性结果(排除因试剂中含有内毒素而导致假阳性)
②呈阳性结果(排除干扰因素)
（4）样品内毒素浓度：λ×B 的终点。
3.1.4 质控与提示
（1）对于一般性的内毒素，可用CSE 代替较贵的参考标准内毒素（RSE），使用时将CSE
和BSE 对比校正。
（2）使用前，剧烈振荡CSE，使其悬浮。
（3）轻柔振荡鲎试剂使其悬浮，避免起泡。
（4）实验应在空气不流动的房间里，无菌的操作台上进行，使用末被内毒素污染的材料。
3.2 内毒素的去除
3.2.1 原理
本法用于去除实验用玻璃器皿上的内毒素。将玻璃器皿置于烤箱中，加热到250℃，持
续30min，即可去除内毒素。
3.2.2 方法与步骤
1.内毒素去除效率的评估
（1）制备浓度分别为1000 和1000EU/mL 的CSE 溶液。按内毒素测量方法检测这些溶液。
（2）向所有待去除内毒素的玻璃器皿滴入1mL 的CSE 溶液。（每种类型的玻璃器皿至少有3EU 的CSE。）
（3）将玻璃器皿置入烤箱中，在60℃下，干烤持续30min，烘干，然后在烤箱中，250℃
下，干烤30min。
（4）加入适量的LAL 水，剧烈振荡5min，以清洗玻璃器皿，然后测量清洗后的LAL 水中的内毒素的浓度。
（5）比较原来的内毒素含量和现存的内毒素浓度。
当内毒素含量至少减少了3－log 时，该方法有效。必要时，重复操作，去除内毒素。
用鲎试验法计算内毒素去除的百分比。
2.去除实验玻璃器皿上的内毒素
确定可使内毒素含量下降3－log 的最佳方案。
对于用来配置无同一内毒素溶液的玻璃器皿，重复操作，直至内毒素含量下降3－log。
（例如，1000→1EU 和10000→10EU）
数个加热循环后，用前述的鲎试验法，测定内毒素含量。
3.对照
阴性对照：用只盛有LAL 水的玻璃器皿，在250℃下，干烤30min 并用LAL 法测量内
毒素的含量。
阳性对照：干燥（60℃，30min）每种玻璃器皿中的内毒素溶液，不经过干烤（250℃，
30min）去内毒素的操作，然后测定其内毒素含量。
3.2.3 质控与提示
（1）确保烤箱散热均匀，为此，在操作过程中，可将玻璃器皿放置在烤箱中的每一层上，
当温度在250℃后，温度的波动不要超过±15℃。
（2）用含1000EU 的内毒素进行的检测，可用来确定去内毒素的效率。用含10000EU 的内毒素进行的检测，可用来确定对内毒素含量较高的器皿去除内毒素的效率。
（3）如果结果不理想，可增加每一次操作的时间和操作次数。
（4）其他技术适用于培养基的去内毒素，例如，超滤，反向渗透，但比较昂贵。选取有效
的滤过膜，确保去内毒素后，培养基的营养成分不丢失并且内毒素含量下降3－log。
细胞培养常见问题及