哺乳动物细胞总RNA的分离

哺乳动物细胞总ＲＮＡ的分离
细胞的裂解
提取步骤
注意事项
　　这一从培养的单层哺乳动物细胞中分离RNA的实验程序系为Favaloro 等（1980）所介绍程序的改良。该程序同样适用于从悬浮培养的哺乳动物细胞中或从易于分散成单个细胞的哺乳动物组织中分离RNA。但不适用于从固体组织中提取RNA，因为用这种裂解细胞的方法（在SDS存在的条件下用蛋白酶K消化）去消化组织速度很慢，导致内源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制剂灭活前有时间发挥作用。原方案中（Favaloro等。1980）采用的裂解缓冲液含有0.015 ％（W/V）的Macaloid（硅藻土），用于吸附并灭活RNA酶。尽管现仍有Macaloid出售NL Chemicals）， 但氧钒核糖核苷复合物和RNA酶的蛋白质抑制剂更常用。下述程序的优点是速度快，并能同时处理很多样品。
一、细胞的裂解
单层细胞的裂解
悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解
a．单层细胞的裂解
a）吸出培养液，以7ml用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲盐溶液PBS冲洗细胞培养皿内的单层细胞，重复1次，将平板置于冰上直至所有单层细胞冲洗完毕。也可将平板放在一块铝板上，再将铝板置于冰盘上。
b）直径为90mm的培养皿需加0.5ml RNA提取缓冲液， 并使之遍布整个平板的表面。
RNA提取缓冲注液
0.14mol/L NaCl
1.5mmol/L MgCl2
10mmol/L Tris.Cl(pH8.6)
0.5％NP-40
1mmol/L二硫苏糖醇（DTT）
100单位/ml胎盘RNA酶抑制剂或20mmol/L氧钒核糖核苷复合物
c）加0.5ml蛋白酶消化缓冲液，用刮棒混匀粘稠状裂解物并将其刮到平板的边缘。
蛋白酶消化缓冲液
0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)
25mmol/L EDTA(pH8.0)
0.3mol/L NaCl
2％ SDS
d）用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3－4次，剪切DNA。
c）加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于37℃温育30分钟。
蛋白酶K以贮存液的形式保存，贮存液为20mg/ml 蛋白K溶液。
b．悬浮培养的细胞或组织单细胞悬液的裂解
a）于4℃以2000g离心5分钟收集细胞，以10倍体积用冰预冷的无钙镁离子磷酸缓冲液悬沉淀，洗涤细胞3次，每次均用大口径的吸管轻轻吹打细胞沉淀，使其彻底分散。
b）估计细胞沉淀的体积，用10-20倍体积的RNA提取缓冲液重悬之。
c）加入与步骤b）所加RNA提取缓冲液体相同的蛋白酶消化缓冲液，用振荡器迅速混匀。用装有21号针头的皮下注射器抽吸细胞裂解物，再将其注入聚丙烯管内。重复3－4次，剪切DNA。
d）加蛋白酶K至终浓度为200μg/ml，充分混匀后置于37℃温育30分钟。蛋白酶K以贮存的形式保存，贮存液为20μg/ml蛋白酶K水溶液。
二、提取步骤
1）用等体积酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白质。
2）用吊桶式转头于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相， 将水相吸至一个新的离心管内，加2.5倍体积用冰预次序的乙醇，充分混匀， 于0℃放置1小时。
3）于0℃以5000g离心10分钟沉淀RNA，弃上清，用含0.1mol/L 乙酸钠（pH5.2）的70％乙酸洗涤沉淀，用自动微量移液器尽可能将乙醇吸尽， 随后于室温放置几分钟，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因为干的核酸沉淀很难溶解。
4）每个直径为90mm的培养皿或每107细胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。
5）分别按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫苏糖醇（DTT），然后分别按1000单位/或10mmol/L 的终深度加台盘RNA酶抑制剂或氧钒核苷复合物。
6）加入无RNA酶的胰DNA酶I至终浓度为2μg/ml，混匀，于37℃温育60分钟。
7）分别按10mmol/L和0.2％的终浓度加EDTA和SDS。
8）用等体积酚：氯仿抽提1次。
9）于室温以5000g离心10分钟使水相与有机相分相， 将水相吸至另一个离心管内，加3mol/L乙酸钠（pH5.2）至终浓度为0.3mol/L，加2.5倍体积用冰预次的乙醇，充分混匀，冰浴放置2小时。
10）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟沉淀RNA。
11）吸出所有的乙醇，将打开管盖的离心管在实验台放置几分钟，让最后残存的痕量乙醇挥发干净。
12）用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70 ℃贮存备用。回收DNA时，只须取出1小份贮存液，加入3mol/L乙酸钠（pH5.2 ）至终浓度为0.3mol/L，充分混匀，用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。
三、注意事项
1．测定最终所得溶液的OD260值可以确定RNA的浓度。取10μl乙醇/TE混合液[步骤13）]离心沉淀RNA，以400水重溶， 测定OD260 值， OD260＝1的RNA溶液每毫升约含40μg RNA。
2.如果需要，可用oligo(dT) －纤维素层析法从所制备的细胞总RNA中纯化无寡脱氧核糖核苷酸污染的mRNA或购买试剂盒进行mRNA的纯化。
3.某些情况下（例如从感染了DNA病毒或用DNA转染的细胞中制备RNA时），必须从细胞总RNA中去除寡脱氧核核苷酸。否则，当用这种RNA构建cDNA库或进行引物延伸反应时应会出问题， 反转录过程中法染的模板DNA片段可能会与RNA杂交而充当引物，从而导致物定mRNA5'末端定位的错误或产生截短的cDNA克隆。
a）步骤12后，加200μl 3mol/L乙酸钠（pH5.2），用自动微量移液器反复吹吸，以重悬核酸沉淀，将悬浮液移至另一个灭菌的微量离心管内。
b）用微量离心机于室温以12 000g离心10分钟，RNA沉于管底，而绝大部分寡脱氧核糖核苷酸仍在上清中。
c）弃上清液，用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸钠（pH5.2），分混匀，加入550μl用冰预冷的乙醇。混匀溶液， 在冰上骤冷30分钟。用微量离心机于4℃以12 000g离主10分钟，以回收RNA。小心吸出上清。d）弃上清液，用300μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，－70℃贮存备用。
回收RNA时，只需取出1小份贮存液，加3mol乙酸钠（pH5.2 ）至终浓度为0.3mol/L充分混匀，用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟即可。如需去除氧钒核糖核苷复合物，用含0.1％羟喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]将RNA终溶液抽提数次即可。
4. 对大多数细胞株来说， 一个直径90mm 培养甲中培养的RNA收率为100-200μg