1.3质粒的扩增和纯化

1．  用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml LB-氨苄青霉素(50μg／ml)

    培养液的聚丙烯管中，于37 ℃，200转／分培养3h。    

 2．  将菌液转入含70 ml LB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37 ℃，200

    转／分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。

3.  菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素

    溶液，终浓度为170 μ／ml)。37 ℃，200转／分培养12-16h。

4.  将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4 ℃离,th,15 min，沉淀细菌。

5.  弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5 min 

6.  加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10 min。

 7.  加入预冷的溶液III 3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10 min，出现白色絮状沉淀。

 8．  6000rpm，4 ℃离心15 min，保留上清。

9．  将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入O.6

    倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10 min。(或-20 ℃4h，或4 ℃过夜，可

    便核酸沉淀)

10.12000 rpm，4 ℃离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残

  兼上清液流尽。

11．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，

    充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5 ml Eppendorf管中。

13．加入用冰预冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混匀。12000 rpm，4 ℃离

  心15 min，以沉淀高分子量的RNA。

14.将上清转移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室

温静置10min。

15.12000 rpm,4 ℃离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残

  余上清液流尽。

16．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，

  充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥发殆尽。

17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉

淀，将溶液转移到另－1.5 ml Eppendorf管中，室温放置1.5ml Eppendorf

管中30min。