关键氨基酸（如酪氨酸，丝氨酸）的磷酸化常常是某些蛋白质加工成熟的重要一步，基于这种研究目的， Osborne 等人 ^[18] 在原有双杂合系统中加入一可将目的氨基酸残基磷酸化的酪氨激酶 Lck ，只有当蛋白质 X ， Y 中同种被磷酸化后，两种融合蛋白才能够彼此结合（图 6-B ）。应用此方法研究在酪氨酸酶 Lck 存在下， IgE 高亲和性受体的γ亚基（ Fc ε RI γ）与一种新的蛋白质的相互作用。 Lck 使该蛋白质的 SH2 结构域（ Src 同源域 2 ）磷化， SH2 构象发生变化从而得以与 Fc ε RI γ相结合，并激活报告基因的表达。

　　小配体三杂合系统（图 6-C ） ^[19] 以小有机化合物共价连接形成的异源二聚体为配体，体现了“二聚化化合诱导物”（ Chemical inducers of dimerization, CIDs ）的概念。 Licitra EJ 与 Jiu JO 利用地塞米松（ Dexamethasone ）与一小鼠糖皮质激素受体（与 LexA BD 融合），以及 FK506 与其受体 FKBP12 （与 AD 融合）的相互作用，构建了第三个杂合配体即地塞米松 -FK506 ，同亲也能激活报告基因。他们利用杂合配基从 cDNA 文库中重新得到了 FKBP12 的 cDNA 。这一系统将 CIDs 与双杂合系统合并使用，在技术上是一个创新，但是，如何使杂合配体顺利扩散进入酵母细胞中仍然是限制其应用的一个重要因素。

　　1996 年， Putz 等人将杂合系统扩展到了 RNA 领域（图6-D ） ^[20] 。他们将 HIV-1 的 RevM10 突变体蛋白与 GAL4BD 融合，并者与其靶 RNA 即 Rev 应答元件（ Rev responsive element, RRE ）结合很紧紧。他们又构建一 RRE 杂合 RNA 文库，即 RRE RNA 与蓁种类 RNA 相连接产生的杂合 RNA 文库，从而在 AD-Y 中筛选出与这些种类 RNA 相结合的 RNA 结合蛋白质，根据已知蛋白质也可寻找与这种蛋白质相互作用的 RNA 。 SeuGupta 等 ^[21] 、 Martin f 等 ^[22] 等人的成功范例预示着有关 RNA 结合蛋白的研究将会更加深入下去。

4 蛋白质相互作用图谱的构建

　　随着基因组研究计划的开展，以及 mRNA 在不同组织器官不同发育阶段的表达图谱的构建（ Body map ），蛋白在不同时空状态下相互作用图谱的构建也逐渐展开。近来双杂合系统最引人注目的应用是酵母蛋白质相互作用的横向研究，以揭示多种细胞活动过程中各控制因子间的联系，并进一步探明至今还不了了解或了解很少的大约 3600 种酵母编码基固执功能。目前已经成功地完成一些小规模的蛋白质相互作用图谱，如 T7 噬菌休（ 55 种蛋白质） ^[23] 和部分真核细胞蛋白亚基等。但是若要对酵母中总共约 6000 种蛋白质进行系统而可信的研究，在筛选方式的自动化程度，数据的精确性，质量的可靠性等方面还需要技术上的进一步提高。

　　Fromont-Racine 等人 ^[24] 应用迭代的方式从高质量的基因组文库中不断筛选出相互关联的一系列诱饵蛋白质。在以前的双杂合系统中将两种重组质粒都转化到同一细胞内，这样所得到的可合理检测到的结果较少。 Fromont-Racine 等采用了相互作用接合技术（ Interaction mating strategy ），将 BD- 诱饵蛋白质（ X ）与 AD- 基因组文库（ Y ）分别转化至两种不同交配型单倍体酵母菌株中，令二者在滤膜上接合，然后涂布于选择培养基上，抵消选出阳性克隆作为诱饵蛋白质进入第二轮筛选（图 7 ）。此方法免除了利用二倍体菌株表达时筛选过程中繁琐的交叉影印以及大量培养皿的使用，并能显著地提高相互作用的效率。

　 图 6 酵母三杂合系统。（ A ）蛋白质和多肽三杂合系统。蛋白质 X 和 Y 的相互作用由蛋白质或多肽配体 Z 介导，形成一稳定的复合体。 Z 可以诱导 X 或 Y 构象改变，促进二者结合，或是诱导受体的胞外结构域二聚体化。（ B ）激酶三杂合系统。酪氨酸激酶（ PTK ）的作用使酪氨酸（ T ）磷酸化（ P ），进而导致相互作用的一方 X 发生构象改变。（ C ）小配体三杂合系统。利用二聚化化合诱导物（ CIDS ）研究受体与有机小配体间的作用。有机小配体是一杂合体；一部分可识别结合蛋白质，另一部分可以是用来筛选其受体的已知小配体，或是对受体进行突变分析；也可以是用来筛选已知 Y 受体的配体的配体文库。（ D ） RNA 三杂合系统。两种杂合蛋白质与一种杂合 RNA 参与相互作用。与（ C ）类似，杂合 RNA 的一部分是已知 RNA ，与蛋白质 X 相互作用，另一部分可用来分析或筛选 RNA 或 RNA 结合蛋白质 Y 。

图7 Fromont-Racine等人采用迭代的方式从基因组文库中不断筛选出相互关联的系列诱饵蛋白质。

图 8 Fields 等人采用的方法。用表达 6000 种 ORF BD 融合蛋白质的每一种酵母菌株重复整个操作，使得 36,000,000 种组合全部得以检验。

　　Fieldst 等人则利用了酵母中已知的约 6000 种蛋白质编码序列。将每一种序列的可读框（ Open Reading Frames, ORFs ）与 BD 融合在酵母菌株中表达，然后与排列有序的待检测异性菌株交配，后乾表达完整的一系列 AD 杂合蛋白质 ^[25] （图 8 ）。此过程已实现自动化，并且不需要大规模测序和特异性控制，因此可望成为构建更大的蛋白质相互作用图谱如人类基因组蛋白质的雏形。但其缺陷是利用全长 ORF 的融合，由于毒性，错误折叠以及立体构象等因素可能致使应有的相互作用缺失，这样导致的结果不完整性有多磊尚待进一步研究。

5 结论

　　自从双杂合系统提出至今八年多来，分子生物学家们不懈的努力终于使得大分子间相互作用研究从过去有限的生化，免疫学技术发展到现在初具规模的各种杂合技术，SPR技术更使得相互作用的动力学研究从技术上有了空前的突破。哺乳动物双杂合系统的应用可较好地解决蛋白质翻译后修饰的问题，不过此技术的缺陷是不能大量筛选转化体，因此今后的一项重要工作还将是把杂合系统更完善的推广到比酵母菌更高等的真核生物体内，以使蛋白质的加工，修饰及相互作用过程更接近于真实状态。另外，构建酶母蛋白质相互作用图谱，利用酵母中与人类相类似的基因进行有关病理学的分子生物学研究等工作也正在生机勃勃地进行着，这些问题的解决必将为揭示细胞生命活动的规律奠定重要的基础。

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The Improvement and Progress of Yeast Two-Hybird System

Qin Baoming   Lou Shujin    Mi Zhiyong   Wu Naihu

(Laboratory of Plant Developmental and Molecular Biology

Institute of Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing   100080, China)

    Abstract   The yeast two-hybrid system was first established by Stanley Fields and OK-kyu Song in 1989. Since then, the system has proven to be a highly efficient genetic tool for detecting protein-protein interactions that utilizes the molecular genetics of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The past few years have witnessed a broad application as well as modification and permutation of the basic two-hybrid system. Such improvements as the Sos recruitment system and mammalian two-hybrid system promise to overcome some limitations of original two-hybrid system. Moreover, the one-and three-hybrid systems and some other realated techniques can now address an even bigger set of questions. In addition , the advanced application of the two-hybrid system has opened the way to the systematic analysis of the protein interaction networks of the yeast complete proteome. Taken together, all these approaches to the study of protein-protein interaction should greatly enrich our knowledge of a wide range of cellualr process. In this review, we introduce the principles of the two-hybrid system and the development and improvement of this technique.

       Key words     yeast, protein-protein interaction, two-hybrid system, one-hybrid system, three-hybrid system.