一、实验目的
通过对链孢霉杂交所产生的子囊孢子的观察，了解分离和交换现象，并进行统计，计算交换值。
二、材料及生活史
1.材料：粗糙链孢霉(Neurospore crassa )属于真菌类，子囊菌纲，球壳目，脉孢菌属，又称为红色面包霉。
2.生活史：粗糙面包霉的营养体是由单倍性(n=7)的多核菌丝组成的。生殖方式有无性生殖和有性生殖两种。无性生殖是菌丝片段或分生孢子经有丝分裂直接发育成菌丝体。有性生殖是不同接合型的菌丝产生有性孢子的过程，主要有两种方式：(1)未受精的营养体菌丝上产生灰白色的原子囊果，可以接受另一不同接合型的分生孢子，通过杂交形成合子。(2)不同接合型的菌丝靠在一起，通过核融合产生异核体。两种有性生殖方式形成的二倍性合子都可以经减数分裂形成四个子细胞，每个子细胞又经一次有丝分裂形成8个子细胞，进一步发育形成8个子囊孢子，并以一定顺序排列在子囊中，许多子囊又被包在黑色的子囊果中。若两个亲代菌株有某一遗传性状的差异，那么经杂交所形成的子囊必定有四个子囊孢子属于一种类型，其它四个子囊孢子属于另一类型。成熟的子囊孢子在适当条件下可发育成菌丝，形成新的一代。它们的子囊孢子的性状的分离比例是严格的1：1，而且有一定的顺序。不同接合型的子囊孢子具有黑色、白色两种类型，在子囊中8个子囊孢子常呈4黑4白的排列方式，因此可在显微镜下直接观察基因的分离现象。当基因发生了互换时，8个子囊孢子又会排列成2黑2白2黑2白或排列成2黑4白2黑或2白4黑2白，因此在显微镜下也可以观察基因的连锁互换现象。
三、材料的优点
1.野生型的子囊孢子成熟较早，在一定时期呈现黑色，赖氨酸缺陷型的子囊孢子成熟较晚，在一定时期呈现灰白色。以上两种接合型的粗糙链孢霉杂交在适当时期可以观察到六种子囊类型。
2.子囊孢子排列的顺序固定，可直接观察到基因的交换。
3.可以计算基因与着丝粒的距离。
4.如果出现A6、a2、A5、a3则表示基因转变。
五、实验步骤
1.菌种活化：为使菌种生活得更好，先要进行菌种的活化。从冰箱中取出保存的野生型和Lys缺陷型的原种，在无菌条件下分别接种在两支完全培养基试管的斜面上，28℃温箱培养5-6天左右。直至在试管中长成许多菌丝，并且在菌丝上部有许多分生孢子时表明菌种活化成功。
2.杂交：取野生型和Lys缺陷型的少许菌丝接种到同一试管的玉米琼脂培养基上，共接两支试管；或者将两种菌丝分别接种到培养皿中“桥”的两侧。在25℃恒温箱中培养2-3周，直至在菌丝上有子囊果出现，子囊果为棕黑色，用镊子或解剖针触摸时有坚实感。
3.观察：
（1）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以防止分生孢子飞扬。
（2）取一载玻片，滴1-2滴5%次氯酸钠，然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上（若附在子囊果上的分生孢子过多，可先在5%次氯酸钠中洗涤，再移到载玻片上），有另一载玻片盖上，用手指压片，将子囊果压破，置显微镜下（10×15倍）检查，即可见30-40个子橐果。观察子囊中子囊孢子的排列情况。用载玻片盖上压片而不用盖玻片，是因为子囊果很硬，若用盖玻片压，盖玻片就会破碎。如发现30-40个子囊果象一串香蕉一样，可加一滴水，用解剖针把子囊拨开。此过程无需无菌操作，但要注意不能使分生孢子散出。观察过的载玻片、用过的镊子和解剖针等物都需放入5%石碳酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。
附：实验用具及培养基配方
实验用具：显微镜、接种针、载玻片、试管、三角瓶
培养基：
1.基本培养基（又称土豆培养基，供接种野生型菌株）50ml用量
A 将土豆洗净削皮，挖去发芽部分，切成黄豆粒大小的碎块，每管放5-6粒。
B 称琼脂1.2克，蔗糖1克，加水到50ml，煮沸溶解。
C 将B分装到A中，每管放3-4ml。
D 做好试管塞，用牛皮纸包好，贴好标签。8磅条件下高压灭菌30分钟。
2.补充培养基（供接种Lys缺陷型菌株)
在基本培养基中加入少许Lys ，其它同上。
3.玉米琼脂培养基（供杂交实验用）
将玉米粒在水中浸泡24小时后晾干，每试管放2-3粒，配2%的琼脂放入蒸馏水中煮沸，每试管倒3-4ml，其它方法同基本培养基。
常用染色液的配制
1.醋酸洋红染液
取45％的醋酸溶液100ml，放入锥形瓶，加入洋红0.5-1g，煮沸约5分钟或加回流煮沸12小时，冷却后进行过滤，再加入1％-2％铁明矾水溶液数滴，直到此液变为暗红色不发生沉淀为止。也可悬入一小铁钉，过一分钟取出，使染色剂中略具铁质、增进染色性能。渺茫液放入棕色瓶中盖紧贮存，并避免阳光直射。
2.苯酚品红（石炭酸）品红染液
母液A：取3g碱性品红，溶解在100ml的70％洒精（可长期保存）。
母液B：取母液A10ml，加入90ml的5％苯酚水溶液。
苯酚品红染液：取45ml的母液B，加入6ml冰醋酸和6ml 37％甲醛。
改良苯酚品红染液：取2-10ml 苯酚品红染液，加入98-90ml 的45％冰醋酸和1.8g山梨醇（注意山梨醇多了，会呈现结晶，影响制片效果）。
改良苯酚品红染液配成后可立即使用，但着色能力差，一般在配制两周后染色能力显著增加。
3.苏木精染液
将苏木精0.5g放入95％洒精10ml 中使其溶解，再加入蒸馏水90ml。此液须经1-2个月成熟。瓶口盖以纱布数层或塞一棉塞以保持通气。临用时过滤。此液可以直接应用或用蒸馏水稀释一倍后使用，可反复使用数次（每次均需过滤）。若不能预先配成，在配时可加碘酸钠使其氧化成熟。苏木精0.5g需加碘酸钠0.1g，溶解后即可使用。
4.Schiff 试剂
取碱性品红1g，放入200ml煮沸的蒸馏水中，用玻璃棒搅拌使其充分溶解。冷至50℃时过虑，加入1mol/L盐酸20ml于溶液内，冷却到20-25℃，加入偏亚硫酸钠（钾）Na2S2O3（或无水亚硫酸氢钠NaHSO3）1-2g，封闭瓶口，置于暗处12-24小时，液体应成淡黄色或无色，若颜色过深可加适量活性炭，过虑后贮于暗处。
5. Giemsa 染液
取0.5gGiemsa粉末，加33ml 纯甘油，在研钵中研细，放在56℃恒温水浴中保温90分钟，再加入33 ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过虑，于棕色细口瓶中保存，作为原液。用时以磷酸缓冲液稀释。
上一篇：《医用细胞工程》教材部分章节word文件 下一篇：免疫磁珠方法分选细胞
|
电泳和Western转印的常见