化学诱变与育种

化学诱变是用化学诱变剂处理植物材料，以诱发遗传物质的突变，从而引起形态特征的变异，然后根据育种目标，对这些变异进行鉴定、培育和选择，最终育成新品种。

    一、化学诱变的特点

    1. 使用经济方便

    　　只需少量的药剂和简单的设备。

    　　2. 有一定专一性

    　　不同药剂对不同植物、组织或细胞、染色体节段、基因的诱变有一定专一性。

    　　如某一诱变剂对某一基因有高效引变作用。这是解决定向突变的一条途径。

    　　3. 与辐射诱变的突变谱很不相同

    　　如 辐射处理大麦，叶绿体突变谱较窄，大多为白花苗。而化学诱变，叶绿体突变谱宽，白化苗百分率下降。

    　　4. 诱变机制与辐射育种不同

    　　辐射诱变 诱变因高能射线造成，染色体结构变异广泛。

    　　化学诱变 化学药剂与遗传物质发生生化反应，结果多是基因的点突变。

    　　因为化学诱变诱发"点突变"，所以更为适用。

    　　辐射诱变染色体或DNA是在辐射时发生的。化学诱变剂作用则是在较晚时发生，即"迟发突变"。

    二、常用化学诱变剂的种类及作用机制

    （一）烷化剂

    　　是栽培作物诱发突变的最重要的一类诱变剂。药剂带有一个或多个活泼的烷基。通过烷基置换，取代其它分子的氢原子称为"烷化作用"所以这类物质称烷化剂。

    烷化剂分为以下几类：

    　　1. 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐

    　　代表药剂：甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）

    　　2. 亚硝基烷基化合物

    　　代表药剂：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU）

    　　3. 次乙胺和环氧乙烷类

    　　代表药剂：乙烯亚胺（EI）

    　　4. 芥子气类

    　　氮芥类、硫芥类

    　　烷化剂的作用机制--烷化作用 作用重点是核酸，导致DNA断裂、缺失或修补。

    　　（二）核酸碱基类似物

    　　这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。

    　　代表药剂：

    　　5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR） 为胸腺嘧啶（T）的类似物

    　　2-氨基嘌呤（AP） 为腺嘌呤（A）的类似物

    　　马来酰肼（MH） 为尿嘧啶（U）的异构体

    　　作用机制：作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去，使DNA复制时发生配对错误，从而引起有机体变异。

    　　（三）其它诱变剂

    　　亚硝酸 能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质，造成DNA复制紊乱。HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。

    　　叠氮化钠(NaN3) 是一种呼吸抑制剂，能引起基因突变，可获得较高的突变频率，而且无残毒。

    用秋水仙素诱导多倍体。

    　　秋水仙素是从百合科植物秋水仙的器官和种子中提取出来的一种剧毒的植物碱。纯品为无色或淡黄色针状结晶，熔点155℃，有苦味，易溶于冷水、酒精、氯仿和甲醛。通常用水或酒精作溶媒。

    　　（1）秋水仙素诱导多倍体的原理

    　　秋水仙素与正在分裂的细胞接触后，可抑制微管的聚合过程，不能形成纺锤丝，使染色体无法分向两极，从而产生染色体加倍的核。

    适宜浓度的秋水仙素溶液，能阻碍纺锤丝的形成，但对染色体结构无明显影响。处理的细胞在一定时间内可恢复正常，重新进行分裂。

    　　（2）秋水仙诱导多倍体应注意的问题

    　　①注意诱变材料的选择

    选主要经济性状优良的品种；

    选染色体组数少的品种因为倍性高的种在进化过程中已经利用了它的多倍性。

    最好选能单性结实的品种因为染色体多倍化后，常会使育性降低。

    尽量选多个品种处理因为不同的种、品种、类型遗传基础不同，多倍化后的表现也不同。

    　　②注意处理部位的选择

    　　处理的组织应该是旺盛分裂的组织。如萌动的种子、正在膨大的芽、根尖、幼苗、嫩枝生长点、花蕾等。

    　　③注意药剂浓度和处理时间的选择

    　　溶液的浓度不宜过高或过低。过高，会引起伤害，以至致死；过低，又不起作用。一般采用临界范围内的高浓度、短时间处理。

    　　通常，草本浓度较低，木本浓度较高。

    　　果树、树木：1-1.5%蔬菜、草本花卉：0.01-0.2%

    　　王鸣等（1960）在甘蓝、白菜、南瓜、萝卜上试验表明，在0.01-0.2%的范围内，随浓度增高，引变的百分率也显著提高。

    　　处理时间以细胞分裂周期为转换。

    　　④注意被处理植物的生长条件

    　　处理后，用清水冲洗,除去残留药物，并为植株生长提供良好的条件，便于植株恢复生长。

    　　外部条件中最重要的是温度，一般25-30℃。

    　　（3）诱导方法

    　　①浸渍法

    　　可用溶液浸渍幼苗、新梢、插条、接穗、种子及球根类蔬菜、花卉等材料。为避免蒸发，宜加盖，避光。

    　　一般发芽种子处理数小时至3d或多至10d左右。秋水仙碱能阻碍根系的发育，处理后要用清水洗净后再播种。发芽种子的胚根，处理后往往受到抑制，发根较慢，为利于根的生长，可在药液中添加适当生长素。

    　　处理插条、接穗一般1-2d。处理后也要用清水洗干净。

    　　处理幼苗时，为避免根系受害，可将盆钵架起来倒置，使茎端生长点浸入秋水仙碱溶液中。

    　　②涂抹法

    　　把秋水仙碱按一定浓度配成乳剂，涂抹在幼苗或枝条的顶端，处理部位要适当遮盖，以减少蒸发和避免雨水冲洗。

    　　③滴液法

    　　对较大植株的顶芽、腋芽处理时可采用此法。常用的水溶液浓度为0.1%~0.4%，每日滴一至数次，反复处理数日，使溶液透过表皮渗入组织内部。如溶液在上面停不住时，可将小片脱脂棉包裹幼芽，再滴加溶液，浸湿棉花。

    　　④套罩法

    　　保留新梢的顶芽，除去顶芽下面的几片叶，套上一个防水的胶囊，内盛有含1%秋水仙碱的0.65%的琼脂，经24h即可去掉胶囊。这种方法的优点是不需加甘油，可避免甘油引起药害。

    　　⑤毛细管法

    将植株的顶芽、腋芽用脱脂棉或纱布包裹后，将脱脂棉与纱布的另一端浸在盛有秋水仙碱溶液的小瓶中，小瓶置于植株旁，利用毛细管吸水作用逐渐把芽浸透，此法一般多用于大植株上芽的处理。

    　　此外，还有注射法、喷雾法等。

    　　秋水仙素诱导也与物理辐射等方法结合使用。如山川邦夫(1973)报道，将好望角苣苔属中的一些种用秋水仙碱处理11d，再用0.05Gy的X射线照射可提高加倍株的出现率。在单独用秋水仙碱处理时为30%，而兼用X射线照射时可提高到60%，并且在取得的多倍体植株中发现有两株变成八倍体。他们认为，这是由于秋水仙碱的处理，使多倍体混杂于二倍体性细胞群中，二倍体细胞由于先开始分裂，所以就被X射线淘汰了。

    　　秋水仙素诱导只能产生偶数多倍体，且为同源多倍体。

    　　有性杂交可产生奇数多倍体、异源多倍体。异源多倍体具有更高的杂合性、育性；二倍体基因渗入，创造遗传多样性，得到杂合多倍性群体。

    三、化学诱变的方法

    1. 药剂配制

    　　硫酸二乙酯（DES）不溶于水，先用少量70%酒精溶解，再加水。

    　　有些烷化剂在水中不稳定，会发生"水合作用"，因此配好的药剂不能贮存，应现配现用。一般都是把它们加入到一定酸碱度(pH)的磷酸盐缓冲液（0.01mol/L）中使用。

    　　亚硝酸也不稳定，常在临使用前将NaNO2加入到醋酸缓冲液（PH4.5），以生成亚硝酸。

    　　2. 试材预处理

    　　干种子 预先浸泡，使细胞活泼，增加敏感性，还可提高膜透性。

    　　细胞处于DNA合成阶段（S）时，对诱变剂最敏感。诱变处理应在S阶段之前进行。

    　　需层积处理的种子，处理前可用层积代替水浸泡。

    　　3. 诱变处理

    　　（1）浸渍法 种子、枝条、块茎浸入诱变剂溶液，或枝条基部插入溶液。

    　　（2）涂抹或滴液法 药剂溶液涂抹或缓慢滴在植株、枝条或块茎的生长点或芽眼上。

    　　（3）注入法 用注射器向植物材料中注入溶液，或将材料人工刻伤，用浸过诱变剂的棉团包裹切口。

    　　（4）熏蒸法 密封容器内使诱变剂产生蒸汽，对花粉等进行熏蒸。

    　　（5）施入法 培养基中加入低浓度诱变剂溶液。

    　　4. 诱变后处理

    　　处理后的材料，用清水反复冲洗，以降低残留，避免生理损伤。一般冲洗10-30min或更长时间。漂洗后的材料立即播种或嫁接。

    　 四、影响化学诱变效应的因素

    除诱变剂种类和材料的遗传类型和生理状态外，还有：处理浓度和处理时间

    　　高浓度处理，生理损伤大；低温、低浓度、长时间处理，M1存活率高，突变率也高。

    　　对种皮渗透性差的种子，应适当延长处理时间。

    　　温度

    　　温度影响诱变剂的水解速度。低温有利于保持化学物质的稳定性。增高温度，可促进诱变剂在材料内的反应速度和作用能力。

    　　适宜处理方式：低温（0-10℃）下，在诱变剂中将种子浸泡足够长时间，使诱变剂进入胚细胞中，然后将种子转移到新鲜诱变剂溶液内，在40℃下处理，加快诱变反应速度。

    　　溶液PH值及缓冲液使用

    　　一些诱变剂在不同的PH下分解产物不同，从而产生不同诱变效应。处理前、处理中都应校正溶液PH值。

    　　使用一定PH的磷酸缓冲液，可提高诱变剂在溶液中的稳定性。浓度不应超过0.1mol/L。

    　 五、安全问题

    大多化学诱变剂有较强毒性或易燃易爆。

    　　如烷化剂大多致癌；氮芥类会造成皮肤溃烂；乙烯亚胺有腐蚀作用，且易燃；亚硝基甲基脲，易爆炸。

    　　所以操作过程中要小心。最后妥善处理残液，以避免污染环境。