除了亲脂性有机溶剂外，超临界流体如二氧化碳(CO2)、氟里昂(CF3H)、烷烃类(甲烷、乙烯、丙烷)或无机化合物(SP6 、N20)等都可以作为酶催化亲脂性底物的溶剂，酶在这些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中一样稳定。超临界流体对多数酶都能适用，酶催化的酯化、转酯、醇解、水解、羟化和脱氢等反应都可在此体系中进行反应，但以水解酶的催化反应研究最多。这种溶剂体系最大的优点是无毒、低黏度、产物易于分离。超临界流体的黏度介于气体与液体之间，其扩散性比一般溶剂高1~2个数量级。超临界流体在临界点附近的温度或压力有一点微小的变化都会导致底物和产物溶解度的极大变化，因而很容易调控超临界流体中酶催化反应的特性，如反应速率和选择性。该体系的缺点是需要有能耐受几百个大气压的高压容器以及减压时易于使酶失活；此外，有些超临界流体如二氧化碳可能会与酶分子表面的活泼基团发生反应，从而引起酶活性的丧失。