§1.AA的降解
一. 共同代谢途径：氨基和羧基的处理。
1. AA的氧化脱氨作用
需要O2参与，可逆反应，将氨基变成酮基，产物即是α-酮酸，由AA氧化酶催化（有L-和D-之分，具有立体专一性），辅酶为FAD或FMN，但不产生能量。总的反应式P412，具体过程为见讲义下P22。AA氧化酶数量少活性低，因此氧化脱氨不是多数AA的氨基主要处理方式。
但是有一种酶例外：L-Glu脱氢酶，其催化的反应见P413，要产生能量，该酶活性高，是Glu的氨基主要处理方式。
2. AA的转氨作用(附重申：进实验室做生化实验时必须着白色工作服，否则，谢绝入内，以后做任何实验都是这样要求)
在转氨酶作用下进行，实际上是移换反应，酮基和氨基的对调，可逆反应。反应式见P413
<1>细胞内的转氨酶种类很多，多数都是“谷Ⅹ转氨酶”，也就是以α-酮戊二酸（P413）为氨基受体的转氨反应，是AA的氨基主要处理方式。其中谷丙转氨酶（见P414）和谷草转氨酶的活性最高：
Glu + 草酰乙酸 ←---→ Asp + α-酮戊二酸
Glu + 丙酮酸 ←---→ Ala + α-酮戊二酸
<2>转氨酶都需要磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺为辅酶（VB6的衍生物，结构见P414），它们是氨基的载体。
<3>转氨酶是胞内酶，以肝脏、心脏含量最高，血液中极少，当肝脏病变时，细胞通透性增大，转氨酶就滲出细胞外，进入血液中，使得血液中转氨酶的活性大大提高，这就是诊断肝炎的原理。
3. AA的联合脱氨作用
是氧化脱氨和转氨的集优化，即L-Glu脱氢酶活性高，谷Ⅹ转氨酶种类多，因此两者的联合是广泛而彻底的氨基处理方式，可逆反应。见P415
4. AA的脱羧作用
由氨基酸脱酸酶催化，辅酶也是磷酸吡哆醛，产物是胺（多数具有毒性和强烈的生理效应），以Glu为例见417。产物γ-氨基丁酸具有抑制中枢神经的作用。
二. 共同代谢产物的去路
1. NH3的去路：鱼类：NH3直接排出体外；鸟类：尿酸；哺乳类：尿素。
人和哺乳动物通过鸟氨酸循环，由NH3和CO2生成尿素。由肝脏生成尿素，进入血液后经肾脏排除（尿）。
意义：<1>生化史上头一次提出的环式代谢，由Krebs（TCA）发现的，具有极其广泛的理论价值<2>降毒作用，NH3的毒性比尿素大得多。<3>将废物CO2也一同除去。
鸟氨酸循环的简要过程：P419掌握
注意几点：
<1>原料的活化：肝脏线粒体中。见P421，由氨甲酰磷酸（结构式P420上）合成酶Ⅰ催化，合成酶Ⅱ则在生长旺盛的肝外细胞的胞浆中。消耗2个ATP。
<2>中间插入的NH3 也不是游离的，而是通过转氨而来的，见P421
<3>每形成1分子尿素须消耗4分子ATP，但产生1分子NADH+H+，故总效果相当于消耗1～2分子ATP，见P421。
2. α-酮酸的去路
<1>回头生成AA：沿着氧化脱氨、转氨、联合脱氨的逆反应。
<2>彻底氧化成CO2和H2O并供能：α-酮酸进入EMP、酮体代谢等过程，最后都要经过TCA，统见P423。注意几点：丙酮酸（Ala）、α-酮戊二酸（Glu）、草酰乙酸（Asp）。
<3>转变成糖类或脂类（酮体：丙酮、乙酰乙酸、β-羟丁酸，它们可以进一步转化成脂类）。
生酮AA：进食之后仅使实验动物尿中的酮体浓度提高的AA，只有Leu，属于必须AA。
生酮兼生糖AA：进食之后使实验动物尿中的酮体和糖的浓度都提高的AA，有Ile、Lys、Phe、Trp、Tyr。除了Tyr均是必须AA。
生糖AA：进食之后仅使实验动物尿中的糖的浓度提高的AA，除了上述以外的AA全是。非必需AA除了Tyr外全是。
三. 除了共同代谢途径之外AA还有特殊的代谢方式。略。
§2.AA的生物合成
一. 由α-酮酸沿着氧化脱氨、转氨、联合脱氨的逆反应回头生成AA。
二. 从头合成：由非α-酮酸通过复杂的代谢形成AA。动物只能形成12种（婴儿期间10种），还有8（10）种，必须由食物中补充，叫必须AA。植物和多数微生物都能合成所有20种基本AA。下面通过一个复杂的代谢图显示各种AA的简要合成途经
Tyr 4-P-赤藓糖 HMS←-- G
↑ ｜ ↓
Phe 植物 ｜｜ 3-P-甘油醛 → Ser → CysGly
↑ ｜ ↓
分枝酸 ← 莽草酸 ← -------- ----- PEP
↓ ↓ 植物
Try Ala ← 丙酮酸 ---→ LeuValIle
↓
Asn ← Asp ← 草酰乙酸 ----- TCA ----- α-酮戊二酸 →Glu→ GlnArgPro
｜｜↓ 植物 和眼虫 ｜｜↓
ThrMetLysIle Lys
His的合成很特殊：以PRPP（磷酸核糖焦磷酸：5-P-核糖-1-Ppi）为前体。
第十三章 核酸的代谢
核酸的分解代谢及核苷酸的生物合成，而核酸的生物合成（复制、转录等）将在后面详述。
§1.核酸的分解
一.核酸的消化吸收：在小肠处被水解为核苷酸水平以下的组分时才能被吸收进细胞内。
核酸酶（磷酸二酯酶） 磷酸单酯酶 核苷酶
核酸 -------→ 核苷酸 ----→ ○P核苷 ----→ BR
↓ 核苷磷酸化酶
B1-P-R

二.碱基的分解：均可在3种水平上进行，碱基、核苷、核苷酸。此处以碱基水平为例
1. 嘌啉的分解：A、G
见P454、455，人、猿、鸟类以尿酸为终产物排除体外，所以人的尿是酸性的。其他动物还要进一步分解。人的痛风症：黄嘌啉氧化酶活性过高时，形成过多的尿酸，它们的钠盐沉积在关节处造成疼痛。可用别嘌啉醇解除，它是黄嘌啉氧化酶自杀性底物。
2. 嘧啶的分解：U、C、T
见P456，生成的β-氨基酸可以部分排除体外也可以进一步分解。
三.核苷酸的生物合成
1. 补救途径：由现成的碱基合成核苷酸
磷酸核糖转移酶
b + PRPP ←-----------------→ NMP + PPi
PRPP：5-P-核糖-1-Ppi,见P457
核苷磷酸化酶 核苷激酶
b + 1-P-R ←-----------→ ○P +核苷 --------→ NMP
ATP→ADP
2. 从头合成途径：在PRPP的基础上合成碱基，当碱基合成完毕，核苷酸也合成了，因此称这种碱基的合成方式是核苷酸水平上的。
<1>嘌啉核苷酸的合成（AMP、GMP）：过程很复杂，重要掌握2点：
PRPP是合成的直接起始物，见P457，在PRPP上添加原料合成碱基，核苷酸也合成了。
嘌啉环上的原子来源：见P457
<2>嘧啶核苷酸的合成（CMP、UMP）：过程很复杂，重要掌握2点：
PRPP是合成的间接起始物，先合成嘧啶环再加到PRPP上。
嘧啶环的原子来源：见P461
3. 核苷酸的衍生物的合成
在4种基本核苷酸的基础上合成NDP、NTP、dNMP、dNDP、dNTP
<1>NDP、NTP的合成
核苷酸激酶 核苷二磷酸激酶
NMP ----------→ NDP -------------→ NTP
ATP-→ADP ATP-→ADP
<2> dNMP的合成：是在DP或TP水平上形成的。
NDP或NTP 核苷酸还原酶系---------------→ dNDP或dNTP 磷酸酶--------→ dNMP
以上只能形成dAMP、dGMP、dCMP三种
dTMP没有与之对应的NMP，它得由UMP转变而来：
核苷酸激酶 核苷酸还原酶系 磷酸酶 dTMP合成酶
UMP --------→ UDP ------------→ dUDP -----→ dUMP --------→ dTMP
ATP→ADP 甲烯FH4
4. 癌症的化疗原理
癌细胞：失去接触抑制，核酸和蛋白质合成异常旺盛，消耗营养制造毒物。
治疗癌症：放射、手术、化疗
癌症的化疗原理：药物抑制核苷酸的从头合成途径。这些药物被设计成核苷酸从头合成途径中有关酶的抑制剂，如氧重氮亮氨酸是Gln的类似物，竞争性的抑制剂，干扰嘌啉和嘧啶核苷酸的从头合成。结构对照见草图；
5-F-U是U的类似物，干扰dTMP的合成。
氨基喋呤和氨甲基喋呤是叶酸（F）的类似物，干扰FH4的合成，进而干扰嘌啉核苷酸的合成。
第十四章 DNA的复制与修复
从本章起，我们进入高级生化的内容，分子生物学。这几章的内容都是近代生化史上最耀眼的成果，它们都与中心法则有关。
中心法则是50年代Creck提出的遗传信息流动之方向的假说，目前其最完善的形式是：
转录 翻译
DNA -------→←------- RNA ---------→←………… 蛋白质
复制 逆转录 复制 逆翻译
§1.DNA的复制
一. DNA复制的一般规律
1. 半保留复制
由一个DNA分子（称亲代DNA）变成2个DNA分子（称子代DNA），这2个子代DNA分子的一级结构完全一样。
在任何一个子代DNA分子中，一条DNA单链来源于亲代，另一条是新合成的，2条链仍然是碱基配对的。
---------------------------- -----→ --------------…………………+--------------…………………
亲代DNA 复制 子代DNA
实验证明：同位素（15N）示踪技术和密度梯度超离心（CsCl），排除了全保留式和弥散式，见P472或草图，证明了只有半保留方式。
---------------------------- -----→ ----------------------------+……………………………………
---------------------------- -----→ --------------…………------+--------…………………………
2. 需要模板和引物，底物是dNTP，
模板是亲代DNA，新链就是以老的DNA单链为模板，按照碱基配对原则合成的。
引物一般是短的RNA，也有用蛋白质做引物的（Φ29噬菌体），也有用DNA单链的（回折）。
3. 复制的方向（新链延伸的方向）
新链按5’--→ 3’方向合成的，见P138解释2种延伸方向。要求底物dNTP具有3’-OH和5’-PPP。
证明：正常底物中掺予ddNTP，如果产物是具有3’端ddNTP，则是按5’--→ 3’方向合成，如果产物中根本没有ddNTP则是按3’--→ 5’方向合成，见P138解释，结果是前者。
4. 有固定的起始点，通常是双向复制，也有单向复制的
见草图。
5. 复制是在解链（局部）基础上进行的
因此会形成复制泡（眼）或复制叉，见P474
6. 复制是半不连续的
从起始点开始一条新链是连续合成的，称为前导链。另一条新链是不连续合成的，称为后随链，后随链中的小片段叫岗崎片段，每合成一段岗崎片段都需要引物，见草图。一个复制泡合成一段岗崎片段，见讲义P33。
二. 参与DNA复制的酶和有关蛋白质
1. DNA拓扑异构酶
引起DNA在正超螺旋、B-DNA、负超螺旋之间互变，以便解链。
ToPoⅠ：消除负超螺旋（原核）、消除正超螺旋（真核），不需要能量。
ToPoⅡ：引入负超螺旋，需要能量。
2. DNA解链酶
破坏DNA双链之间的氢键，使DNA解链，需要ATP供能。目前发现4种。
解链酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Rep蛋白，其中解链酶Ⅱ与后随链之模板结合，Rep蛋白则与前导链之模板结合。
3. 单链结合蛋白SSB：Single Strand Binding
结合在模板DNA单链上，防止已解链的DNA重新形成双链。
4. RNA引发酶
负责合成一个小片段RNA，作为新链DNA的引物，此酶就是一种RNA聚合酶，受利福平抑制。
5. DNA聚合酶：依赖于DNA的DNA聚合酶
<1> DNA聚合酶是DNA复制最重要的酶，催化反应：
模板/引物-3’-OH + dNTP Mg2+-------→DNA聚合酶 模板/引物-dNMP-3’-OH +PPi
由上式可知底物是dNTP，复制方向是5’--→ 3’。
<2>在E.coli中，共发现了3种DNA聚合酶：DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。
DNA聚合酶Ⅰ，Kernberg发现，诺贝尔奖得主，该酶是个多功能酶，共具有：
5’--→ 3’聚合； 3’--→ 5’外切，用于自我校对，即当聚合过程中出现碱基配对错误时，该酶聚合活性丧失，3’--→ 5’外切活性激活，但矫枉过正，多切除了10％，然后又恢复聚合活性；5’--→ 3’外切，用于切除引物；水解PPi，加快聚合反应并使之不可逆。DNA聚合酶Ⅰ不是E.coliDNA复制中的最主要酶，这是因为。DNA聚合酶Ⅰ缺陷型的E.coli照样存活。
DNA聚合酶Ⅱ：与DNA聚合酶Ⅰ功能相似，但没有5’--→ 3’外切。
DNA聚合酶Ⅲ：与DNA聚合酶Ⅰ功能相同，其聚合活性比DNA聚合酶Ⅰ高1000倍，是E.coliDNA复制中的最主要酶。
<3>真核生物中的DNA聚合酶，共有5种：DNA聚合酶α、β、γ、δ、ε，除了γ在线粒体中外，其余都在细胞核中。
6. 切除引物以及填补空白的酶
当DNA复制达到一定程度之后，引物将被水解掉，由引物酶作用，这样前导链尤其是后随链（岗崎片段之间）就出现了空白，再由填补空白的酶以岗崎片段为引物，合成一段新链，见草图解释。在E.coli中，这2种酶都是由DNA聚合酶Ⅰ来充当的。
7. DNA连接酶：将各片段之间形成3’,5’-磷酸二酯键，使新链都连续完整。
三. DNA复制的过程：起始→延伸→终止
1. 起始
起始点的识别 引发酶：一种RNA聚合酶
↓
解旋、解链 拓扑异构酶、解链酶、SSB，形成复制泡
↓
引物合成 引发酶、NTP、碱基配对
其过程参见讲义P35，注意：应该是双向复制，为了简单明了，只画了单向。
2. 延伸：
DNA聚合酶、模板、dNTP、碱基配对、3’，5’-磷酸二酯键、前导链、后随链（岗崎片段），占满一个复制泡，见讲义P35补页。继续解旋解链，继续合成前导链和后随链（每一段岗崎片段都需要引物），见讲义P35补页之反面。在E.coli中这个DNA聚合酶是Ⅲ。
3. 终止：没有终止点，直到合成完毕。伴随着
引物切除 引物酶：一种RNA外切酶
↓
空白填补 DNA聚合酶，在E.coli中是Ⅰ
↓
片段连接 连接酶
见讲义P35补页之反面。注意：这一过程并不是要等到新链完全合成完毕后才进行，而是在延伸时就在进行。另一
四. 复制的模型
1. θ复制模型：质粒、原核生物染色体DNA、真核生物细胞器DNA都是双链环状DNA，它们的复制符合θ复制模型。其特点是：由一个起始点开始，按照DNA复制的一般过程双向复制，复制过程中形成θ性状，复制完毕后，2个DNA分子相交，由拓扑异构酶Ⅱ来分开（先切开后连接），见P475
2. 滚环复制模型：噬菌体φχ174的DNA是单链环状的，它的复制见讲义P35
首先借用宿主（E.coli）中的DNA复制系统（聚合酶、底物等），以自身的DNA为模板（+链），合成一条负链；
再由病毒自身携带的A蛋白内切-链，A蛋白并与-链的5’端之5’-P共价结合，A蛋白又与质膜连接，这样就把+-DNA链悬挂在了质膜上。
解下来发生的解链过程就好像是+链沿着-链滚动的过程，并以+链为模板，-链为引物合成前导链，而以-链为模板合成后随链，这样继续滚动，可以无止境的合成下去。
五. 真核与原核生物DNA复制的比较
1. 真核、原核生物DNA复制过程基本相同，都有起始、延伸、终止三个阶段。
2. 真核生物的染色体DNA要与组蛋白组成核小体（串珠结构，见草图），要先解聚，裸露出DNA，因此，起始过程比原核生物复杂。
3. 真核生物DNA复制时，有多个起始点，原核生物只有一个，虽然从每个起始点看真核的速度都慢于原核，但总速度却大于原核。
4. 真核生物DNA复制时，只复制一代，而原核生物DNA可以多代同时复制，当第二代DNA尚未复制完毕时，第三代、第四代DNA就已经开始复制了，形成多重复制泡现象。见草图。
5. 真核生物DNA复制时，组蛋白也同步合成，而且是全保留的合成，原核生物没有。
6. 真核生物的DNA聚合酶有5种，原核生物只有3种。
六. 2个难题的解决
1. 前导链和后随链的齐头并进问题
前导链连续合成，只有一个引物，而后随链不连续合成，有很多引物（每个岗崎片段都有一个引物），理论上讲应该合成得慢一些，但实际上是齐头并进的。？
DNA聚合酶是个二聚体，后随链的模板链扭转180度。见草图。
2. 末端的烦恼
中途切除RNA引物后，可以以相邻的岗崎片段为引物来填补空白（见草图解释），但当合成完毕后，每个新链的5’端切除RNA引物就再也没有相邻的任何东西做引物，那么，这个空白是如何填补的呢？
首先在每个模板的3’端连接一段寡聚脱氧核苷酸，然后自身折转做引物，合成一段前导链，直到把空白填满，最后将该段寡聚脱氧核苷酸切除。见草图。
§2.DNA的损伤和修复
一. DNA的损伤：生物体在生长繁殖过程中要经历无数次DNA复制，生物体的细胞与环境也物时不在相互作用，这就难免DNA会出错。
1. 碱基错配
在DNA复制过程中，新链中的个别碱基逃避了DNA聚合酶的校正作用，没有遵循碱基配对原则与模板严格配对，这就是DNA的碱基错配损伤。其后果是不能正常复制和转录，造成1/2子代变异。见草图
2. 嘧啶二聚体
DNA受紫外线照射，相邻的两个嘧啶碱基会形成共价键，叫嘧啶二聚体，最常见的是
∧
TT
导致DNA变形，不能正常复制和转录（不能严格的遵守碱基配对原则），常常致死，这就是紫外线杀菌的道理。同样也会造成1/2子代变异。见草图。
3. 甲基化
烷化剂如化学武器（芥子气，二战中）、煤焦油可导致DNA上碱基的甲基化，例如将G→mG，不能正常复制和转录（不能严格的遵守碱基配对原则）。
4. 脱氨
据估计，人的DNA每天脱氨1000次以上，可使C→U、A→I，导致DNA不能正常复制和转录（不能严格的遵守碱基配对原则）。
二. DNA的修复：DNA的损伤都会造成DNA该处碱基不严格配对，使DNA分子变形，为修复酶提供了识别依据。
1. 直接修复：仅需要一种酶的作用就可以一次性将DNA损伤修复。
<1>光复活作用
微生物在紫外线照射后，暴露在强烈的可见光下，其存活率明显提高（比放在暗处）。
微生物细胞内存在一种光复活酶，能识别嘧啶二聚体，并切开其共价键，使DNA恢复正常，该酶受可见光激活。平时该酶在DNA上滑动（象火车），识别并附着在嘧啶二聚体处，有可见光即被激活，切开共价键，使DNA恢复正常。人和哺乳动物没有此酶。
<2>甲基转移作用
甲基转移酶能够识别甲基化的碱基，如mG，它将甲基转移到自己身上（-SH），修复了DNA但牺牲了自己-----自杀性底物又一例子。
2. 间接修复：需要多种酶的共同作用才能将DNA损伤修复，这些酶包括DNA内切酶、DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等，修复过程是切除错误部位、填空、连接。
<1>碱基切除修复
针对脱氨的碱基，由DNA糖苷酶先把错误的碱基切除，使该处成为无碱基位点（AP位点），再由AP核酸内切酶和外切酶共同作用，将AP位点切除，然后由DNA聚合酶填空，DNA连接酶连接。
<2>脱氧核苷酸切除修复
由DNA内切酶、外切酶共同作用切除损伤部位的脱氧核苷酸，然后由DNA聚合酶填空，DNA连接酶连接。
3. 重组修复
这是一种通过复制来修复损伤的方式。见讲义P38草图。

第十五章 转录和逆转录
本章讲解依赖于DNA的RNA生物合成(转录)，依赖于RNA的RNA生物合成(RNA复制)，依赖于RNA的DNA生物合成(逆转录)
§1.转录的一般规律
一. 需要模板，不需要引物，底物是NTP（具有3’-OH），遵守碱基配对原则（T/U）。
模板就是基因的一条链，称模板链，可以与合成出来的RNA互补，基因的另一条链叫编码链与合成出来的RNA碱基序列相同（T/U）。
二. 转录的方向即RNA延伸方向5’→3’。
三. 转录时DNA也需要局部解链，但不需要解链酶和SSB，解链工作直接由RNA聚合酶来充当，转录过程中释放出RNA链，DNA重新形成双螺旋，并不形成杂交分子，见讲义P42草图。
四. RNA聚合酶是转录中最重要的酶，全名叫依赖于DNA的RNA聚合酶，催化的反应如下：
Mg2+
DNA模板 + nNTP -------------------------→ RNA + nPPi + DNA模板
RNA聚合酶
PPi由焦磷酸酶水解成○P
1. 原核生物中的RNA聚合酶：只有一种。
<1>酶的组成：
全酶：α2ββ’σ，是个寡聚酶。
核心酶：α2ββ’结合相对紧密，与σ结合松弛。
<2>各亚基的功能：
α：支持作用
β：催化亚基：受利福平和利链霉素抑制。
β’：与模板接合，是个碱性蛋白，含有Zn2+
σ：起始因子，识别启动子，仅参与转录的起始，起始过程结束后，它就离开。没有σ的核心酶可以合成RNA，但起始点不定，模板链和编码链也不定。
2. 噬菌体的RNA聚合酶
噬菌体没有RNA聚合酶，它可以将宿主的RNA聚合酶略加修饰，就转成了自己的RNA聚合酶，这种RNA聚合酶对宿主的RNA合成活性降低或丧失。
3. 真核生物的RNA聚合酶：五种，详见下表：
RNA聚合酶 Ⅰ（A） Ⅱ（B） Ⅲ（C） 线粒体 质体
细胞定位 核仁 核质 核质 线粒体 质体
转录产物 rRNA mRNA tRNA 线粒体RNA 质体RNA
α-鹅膏覃碱 高度不敏感 高度敏感 中度敏感 不敏感 不敏感
α-鹅膏覃碱：是毒蘑菇中含有的一种毒素，8肽，见P484。
§2.转录的过程
分为起始、延伸、终止、后加工4个阶段。
一. 原核生物转录的过程
1. 起始
<1>正确的起始依靠启动子，这是基因上游的一段DNA片段，包括2个盒子，见讲义P40草图，第一个盒子位于-10bp处，叫Pribnow Box，保守序列（编码链5’→3’）为TATAAT。第二个盒子位于-35bp处，保守序列为TGTTACA
<2>起始过程：启动子的识别和第一个3’,5’-磷酸二酯键的形成。
全酶α2ββ’σ沿着DNA分子滑动
↓
滑到第二个盒子时，与DNA形成紧密的复合物，见讲义P41草图
↓
缓慢滑到第一个盒子，与DNA形成开放的复合物（β’链），并解链，见讲义P41草图
↓
滑到基因模板链的第一个碱基时，β链拾取一个与之互补的NTP，利用氢键将它暂时挂在模板上
↓
β链接着拾取一个与模板链的第二个碱基互补的NTP，也将它暂时挂在模板上，并与第一个NTP形成3’,5’-磷酸二酯键，释放出PPi
2. 延伸：核心酶沿着模板链的3’→5’方向移动，进行RNA的聚合（5’→ 3’），每移动一步，合成7～8个NTP。
3. 终止：基因上有转录的终止信号，它要么能被ρ因子（一种蛋白质）识别，要么导致刚合成出来的RNA的3’端形成一个特殊的发夹结构-----终止子，来结束RNA的合成。
4. 后加工：原核生物的mRNA不经过后加工，rRNA和tRNA是多顺反子（多个基因转录到同一条RNA上），需要后加工。
二. 真核生物的转录
1. 真核生物的染色体结构复杂，在转录时要发生非常复杂的构象变化。
2. 真核生物的RNA聚合酶高度分工，共有五种，不同的酶合成不同的产物，原核生物只有一种酶。
3. 转录所需要的因子比原核生物多
4. 真核生物基因前除了有启动子外还具有其它一些序列，影响转录，它们是
增强子：远离基因的一段DNA序列，能提高转录速度。
沉默子：远离基因的一段DNA序列，能降低转录速度。
这些东西与基因处于同一条DNA分子上，称为顺式作用元件。
它们起作用必须要蛋白质结合在其上，这些蛋白质又是由另一条染色体上的基因产生的，叫做反式作用因子
5. 真核生物的mRNA要经历复杂的后加工，原核生物不需要加工，一合成出来就是成熟的
6. 真核生物mRNA的转录是单顺反子转录，即一次只有一个基因转录，翻译出一种蛋白质。而原核生物是多顺反子转录，即一次多个基因转录到同一条RNA上，这是由于多个基因共同享用一个启动子。
三. RNA的后加工:从刚刚合成出来的RNA到成熟RNA的过程.
1.mRNA的后加工
原核生物没有，它刚一合成就成熟，通常是边转录边翻译边降解，而真核生物刚合成出来的RNA是不能进行翻译的，叫前体RNA，经复杂的后加工后才成熟。
<1>5’端戴帽：当转录尚未完成时，这一戴帽过程就已经开始了。
帽子是m7GTP，见P146。
戴帽子的过程是：刚合成出来的RNA的5’端核苷酸的形式是NTP，除此之外都是NMP（表示为pppXpYp，见P146），帽子以其5’位上的PPP与RNA的5’端的NTP的5’位上的PPP连成一线，去掉3个P后缩合到一起，就形成了m7G5’ppp5’XpYp.
5’端戴帽的意义为：防止5’→3’外切；容易被核糖体等蛋白质合成系统识别；并作为翻译的起始信号。
<2>3’端加尾：
尾巴是PolyA，也就是AAAAA……。
加尾过程：RNA刚刚合成完毕时，其3’端附近有一段保守序列AAUAAA，称为PolyA结合位点，由RNA内切酶将此位点后的序列切除，再由腺苷酸聚合酶不需要模板合成一段PolyA。
3’端加尾的意义：防止3’→5’外切；便于亲和层析纯化mRNA，即用固定化的PolydT或PolyU来钓mRNA。
注意：组蛋白的mRNA例外，没有PolyA尾巴。
<3>化学修饰：例如m6A，其意义在于自身识别。
<4>剪接：真核生物的基因为断裂基因，内含子与外显子交替排列，合成出来的RNA也是如此，因此需要切除内含子，把所有的外显子连接起来。
<5>编辑：通过个别碱基的改变，如插入或删除，造成mRNA序列与原基因编码链的序列不同，其意义是引入起始密码和终止密码，校正基因突变。
2.tRNA和rRNA的后加工
它们都是多顺反子转录，因此都要经过剪切过程。正是在研究rRNA的后加工过程中发现了核糖酶。
tRNA还要经过化学修饰（产生T、ψ、二氢尿嘧啶），3’端加尾CCA-OH
四. RNA合成的抑制剂
利福平、利链霉素：抑制原核生物以及真核生物线粒体、质体的RNA聚合酶。对其它真核生物RNA聚合酶没有影响。药物。
α-鹅膏覃碱：抑制真核生物的RNA聚合酶，对原核生物以及真核生物线粒体、质体的RNA聚合酶没有影响。
放线菌素D：与DNA模板的dGMP结合阻止RNA的延伸，可以用来区别转录与逆转录。
§3.逆转录与RNA的复制
一. 逆转录：以RNA为模板合成DNA的过程，只有RNA病毒（如艾滋病毒）具有此种现象。
1. 逆转录酶：由RNA病毒自身携带的酶，是个多功能酶，具有三种功能
依赖于RNA的DNA聚合酶：以RNA为模板合成DNA，叫互补DNA（cDNA）
RnaseH：水解杂交分子中的RNA
依赖于DNA的DNA聚合酶
2. 逆转录过程：RNA病毒自身携带有逆转录酶以及引物tRNA，注入到宿主细胞后，发挥第一种功能，以RNA为模板、tRNA为引物，合成cDNA；接着发挥第二种功能，水解杂交分子中的RNA；最后发挥第二种功能，再合成一条DNA单链。这样就把RNA上的遗传信息传递给了DNA，这个DNA可以整合到宿主细胞的DNA中，到时候转录出病毒的RNA、tRNA，翻译出病毒的逆转录酶和蛋白质外壳，包装成完整的病毒。
二. RNA的复制
仅出现在RNA病毒中，需要由病毒RNA编码的RNA复制酶，即依赖于RNA的RNA聚合酶，由于病毒的结构不同，RNA的自我复制也有区别。
1. 正链RNA病毒
这种病毒只含有一条RNA单链，具有RNA复制酶和壳蛋白的编码信息，称为正链，注入到宿主细胞后，它可以充当mRNA，翻译出RNA复制酶，又可以充当模板合成一条互补的RNA单链，称为负链，再以负链为模板合成正链。适当的时候翻译出壳蛋白，组装成完整的病毒。
2. 负链RNA病毒
这种病毒只含有一条RNA单链和一个RNA复制酶，注入到宿主细胞后，它不能充当mRNA，只能充当模板，因此叫负链RNA，在RNA复制酶的作用下，以负链RNA为模板合成一条正链RNA，它既可以充当mRNA，翻译出RNA复制酶和壳蛋白，又可以充当模板合成负链RNA。适当的时候组装成完整的病毒。
3. 双链RNA病毒
含有双链互补的RNA分子和一个RNA复制酶，注入到宿主细胞后，首先RNA复制酶以负链为模板合成一条正链RNA，它既可以充当mRNA，翻译出RNA复制酶和壳蛋白，又可以充当模板合成负链RNA。适当的时候组装成完整的病毒。
第十六章 翻译
翻译即mRNA指导下的蛋白质生物合成
§1.蛋白质生物合成的一般规律
一. 模板：mRNA；载体：tRNA；底物：AA；场所：核糖体。
二. 极性：多肽链的延伸方向是N→C，即沿着模板mRNA的5’→3’。证明：体外翻译系统+同位素示踪+放射自显影。体外翻译系统指仅含有蛋白质生物合成的一切物质的体外系统（不是整个细胞），目前使用的最好的是小卖麦胚、大肠杆菌、网织红细胞三者的抽提物。
三. 遗传密码：mRNA（或基因）上的核苷酸序列（碱基序列）与蛋白质中的AA序列之间的对应关系。
1. 密码子
<1>mRNA（或基因）上的3个连续碱基决定一个AA，这3个连续碱基就是密码子。
<2>密码子与AA的具体对应关系见P496，这一关系的发现有赖于核糖体结合技术，在体外翻译系统中加入人工合成的三聚核苷酸，充当mRNA，再掺入一种放射性同位素标记的AA，如果这个三聚核苷酸正好是该AA的密码子，则会形成核糖体-三聚核苷酸-*AA-tRNA的四聚体，用硝酸纤维滤膜很容易将这个四聚体分离出来（如果有的话），检查放射性就知道有没有。
<3>密码表中的几个重要密码子（8个）：
起始密码：也就是第一个密码子，无论原核还是真核都是AUG，原核生物对应的是fMet，真核生物对应的是Met。极少数原核生物用GUG，对应fMet。不作起始密码时，也就是处于中间时，AUG对应的是Met，GUG对应Val。
终止密码：UAA、UAG、UGA，它们是空密码，不对应任何AA。
易记密码：AAA：Lys
GGG：Gly
CCC：Pro
UUU：Phe
2. 密码子的主要性质
<1>简并性：1种AA可以有几个密码子，但一个密码子只能决定一种AA，例如：Leu：CUA/CUG/CUC/CUU，其意义是减少突变的影响。这样根据mRNA（或基因）的碱基序就能决定唯一的一条多肽链，反过来就不可以。
<2>密码子中间的一个碱基通常决定了AA的性质：嘧啶-疏水AA；嘌啉-亲水AA；记作苏蜜一号西瓜。
<3>通用性与例外：一切生物包括真核、原核、病毒都使用同样的遗传密码，只有线粒体例外，如果细胞核产生的mRNA进入到线粒体中，将合成出怪异的蛋白质。
<4>不重叠、不跳跃：从起始密码AUG开始，一直都以三联体连续阅读，中间不重叠、不跳跃，见P497，这叫开放的阅读框架。
3. 密码子和反密码子之间的作用-摆动学说
反密码子是tRNA的反密码环上的特定三联体，见P148tRNA的三叶草模型。请注意反密码子与密码子的配对也要反向平行。
密码子和反密码子之间的作用遵循Creck提出的摆动学说
<1>原则上要求碱基配对：请注意反密码子与密码子的配对也要反向平行。例如密码子AGC就要与反密码子GCT配对：
密码子（mRNA） 5’-AGC- 3’
反密码子（tRNA） 3’-TCG- 5’
<2>密码子的前两个碱基要求与反密码子严格配对，最后一个碱基可以不严格配对。
<3>摆动学说的意义：便于mRNA 与tRNA分离。
§2.参与蛋白合成的重要物质
一. 核糖体：是蛋白质合成的场所
1. 组成：
rRNA 原核5S、16S、23S三种
真核5S、 5.8S 、18S、 28S四种
蛋白质 多种
2. 形态
<1>亚基：
大亚基 原核50S
真核60S
小亚基 原核30S
真核40S
<2>单核糖体：1个大亚基+1个小亚基，原核70S（50+30），真核80S（60+40），S不能简单的相加。见P503或讲义P49草图
<3>多聚核糖体：由一条mRNA串起来的多个核糖体，见P509或讲义P49草图。
3. 功能
结合mRNA：夹在大亚基和小亚基之间，见P504或讲义P49草图。
结合氨酰tRNA、肽酰tRNA：在大亚基上，见讲义P49草图。
A位：结合氨酰tRNA的部位，Amino…，第一个氨酰tRNA例外。
P位：结合肽酰tRNA的部位，Peptide…，fMet-tRNAfMet例外。
E位：结合空载tRNA，Exit
形成肽键：由肽酰转移酶作用，最新的发现表明此酶由rRNA（原核23S）来充当。
二. 成熟的mRNA
1. 原核生物的成熟的mRNA特点：没有5’端帽子和3’端尾巴，但有SD序列，即夹在5’端点和起始密码之间的一段不翻译序列，富含嘌啉，这是保证原核生物翻译正确起始的结构，SD序列可以和小亚基上的16SrRNA中的反SD序列相结合，决定翻译的正确起始。故在基因工程中要加上SD序列。
2. 真核生物的成熟的mRNA特点：有5’端帽子和3’端尾巴，但没有SD序列，正确的起始靠5’端帽子。
三. AA、tRNA、氨酰tRNA合成酶
基本AA只有20种，而tRNA的种类多得多，所以tRNA也有简并性，即一种AA可以被几种tRNA来运载。
氨酰tRNA合成酶的专一性很强，它能准确的辨认某种AA与带有该反密码子的tRNA，并在两者之间形成酯键，形成的部位是，AA的羧基与tRNA的3’端的CCA-OH，反应式为
氨酰tRNA合成酶
AA + tRNA ------------------------→ AA-tRNA
ATP↓AMP+PPi
消耗2分子ATP。
原核生物起始时的fMet-tRNAfMet与中间的Met-tRNAMet是由同一种酶催化的。
四. 其它因子
起始因子：IF，Initiation Factor
延伸因子：EF，Elongation Factor
终止因子：RF，Release Factor
§3.蛋白质合成的过程
AA的活化、起始、延伸、终止、肽链后加工
一. AA的活化
形成氨酰tRNA，见氨酰tRNA合成酶的反应式，20种基本AA都需要活化。
特殊情况：原核生物起始密码AUG对应的AA活化形式是fMet-tRNAfMet
二. 翻译的起始
1.正确的起始机制：识别起始密码AUG，AGCUAUGAAUGGGAUG……GUAGGAAC？
原核生物靠5’端的SD序列，可以和小亚基上的16SrRNA中的反SD序列相结合，其后第一个AUG就是起始密码。
真核生物靠的是5’端帽子结构，帽子后面的第一个AUG就是起始密码。
2. 原核生物起始的过程：在IF的作用下，核糖体、mRNA、fMet- tRNAfMet形成70S的三元复合物，见P504，其中，mRNA夹在核糖体的大小亚基之间，fMet- tRNAfMet位于大亚基的P位上而不是A位（核糖体误将fMet当作肽），tRNAfMet上的反密码子与mRNA上的起始密码AUG相结合。见P504，这一过程要消耗1个ATP。
三. 肽链的延伸
1. 进位：在EF作用下，由GTP供能，第二个AA-tRNA进入核糖体大亚基的A位，见P505
2. 转肽（形成肽键）：在肽酰转移酶（23SrRNA）的作用下，将“假肽酰”fMet从tRNAfMet身上转到第二个AA-tRNA的AA的氨基上，形成肽键，得到二肽酰tRNA：fMet-AA-tRNA，以及空载的tRNAfMet，见P506，此步不需要能量。
3. 移位：在移位酶的作用下，由GTP供能，核糖体沿着mRNA的5’→3’移动一个三联体密码的距离，使空载的tRNAfMet进入E位，准备退出；肽酰tRNA进入P位；第三个AA-tRNA进入A位。见P507
4. 反复进行1.2.3.步，肽链沿着N→C方向延伸。
四. 翻译的终止
1. 当肽链延伸到终止密码时，因为它是空密码，没有任何tRNA与之对应，故A位空出，RF进入A位，使肽酰转移酶变为水解酶，释放出肽链和tRNA。
2. 生物体为了加强终止，通常设置了两个以上并排的终止密码。所以要合成含n个AA残基的肽链，mRNA至少含有3n+6个核苷酸。
五. 肽链的后加工
1. 端点的加工
原核生物N端去甲酰化、切除fMet。真核生物N端切除Met。N端甲酰化。使得成熟蛋白质的N端多样化。“凡是原核生物，蛋白质N端皆fMet”、“凡是真核生物，蛋白质N端皆Met”的说法是不对的。
C端氨酰化。
2. 信号肽、导肽的切除
信号肽：分泌蛋白和膜蛋白，其N端有一段疏水AA（约20～30个），保持着一级结构，能穿入或穿透细胞膜，就像针带线，当穿入或穿透细胞膜后就被水解掉。
导肽：由细胞质合成的某些细胞器蛋白（如线粒体蛋白），其N端有一段碱性AA（约20～30个），能穿透细胞器的膜，也像针带线，当穿透细胞器的膜后就被水解掉。
3. 蛋白质内含子的切除：例如切除胰岛素原的C肽。
4. AA的修饰：○P化（糖原磷酸化酶b的激活）、糖基化（糖蛋白）、OH化（羟脯氨酸）、GDP化（G蛋白）等
5. 二硫键的形成，由此衍生出Cyss
6. 与辅基相连：如血红素
六. 真核生物与原核生物蛋白质合成的比较
1. 核糖体不同：原核70S（50+30），真核80S（60+40）
2. 起始AA不同：原核是fMet，真核是Met。
3. 起始机制不同：原核SD序列，真核5’端帽子。
4. 起始复合物的形成过程不同。略。
5. 真核生物过程更复杂，需要的因子更多。
七. 蛋白质合成的抑制剂
原核 绿霉素、红霉素、链霉素、四环素、新霉素、卡拉霉素
真核 梭链孢酸、放线菌酮、蓖麻毒素、白喉毒素、干扰素（抗病毒）
原核与真核 嘌啉霉素、
第十七章 基因工程、基因表达、核酸测序
一.基因工程
上个世纪七十年代发展起来的一项新技术，将成为本世纪最具前途的工业。
把不同来源的基因按照设计蓝图重新整合成一个新的基因组（即DNA分子），再把它引入细胞中，构成具有新的遗传特性的生物，为人类服务。
它的意义在于，借用工程设计的思想，克服了生物种间限制，定向创造新的物种。
基因工程的一般步骤如下：见讲义草图P72，整理如下
1. 根据需要提出设计
2. 分离带有所需基因的DNA片段
3. 改造作为载体的DNA
4. 把2、3体外重组
5. 把重组的DNA分子引入受体细胞
6. 分离这些纯系增殖细胞
7. 使外来基因在受体细胞内表达
一. 基因表达调控
基因表达：基因如果进行了转录进而翻译，就叫基因表达，否则就叫基因不表达。基因表不表达，什么时候表达，都受到严格的调控。真核生物细胞的分化就是因为基因表达不同造成的。
基因表达的调控可以分为DNA水平（拓扑异构和启动子的结构）、转录水平（操纵子模型、基因重排）、翻译水平三种水平。
1. 操纵子学说之一-------乳糖操纵子
提出者：法国人，Jacob和Monod，诺贝尔奖金得主。
乳糖操纵子的现象：E.coli中与乳糖利用有关的酶是半乳糖苷酶（LactZ）、透性酶（LactY）、转乙酰酶（LactX）三种，当培养基中不含有乳糖时，细胞基本上不产生这三种酶（5个/细胞），当培养基中加了乳糖时，细胞产生很多这三种酶（5000个/细胞）。符合经济原则。
乳糖操纵子模型：
<1>E.coli的DNA上有关乳糖操纵子的结构包括：见讲义草图P55
调节基因I或R 产生有活性的阻遏蛋白，它能结合操纵基因（O），阻止RNA聚合酶的通过，不能转录。诱导物乳糖可以跟它结合，使其失活，不能结合操纵基因（或从操纵基因上掉下来），转录得以正常进行。
控制元件 启动子（P）：RNA聚合酶的驻地
操纵基因（O）：能被有活性的阻遏蛋白结合，阻止RNA聚合酶的通过，不能转录。
结构基因 Z：产生半乳糖苷酶（LactZ）
Y：产生透性酶（LactY）
X：产生转乙酰酶（LactX）
<2> 乳糖操纵子模型的作用机理：培养基中不含有乳糖时，调节基因产生的阻遏蛋白有活性，它能结合操纵基因（O），阻止RNA聚合酶的通过，不能转录。培养基中加了乳糖时，乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使其失活，不能结合操纵基因（或从操纵基因上掉下来），转录得以正常进行。见讲义草图P55
2. 操纵子学说之二-------组氨酸操纵子
现象：当培养基中不含有His时，细胞产生很多的His合成酶。当培养基中加了His时，细胞基本上不产生His合成酶。也符合经济原则。
His操纵子模型：
它与乳糖操纵子模型不同的地方在于，调节基因产生的阻遏蛋白是没有活性的，它需要结合His后才具有活性，这里His不是诱导物而是辅阻遏物。
三. 核酸测序
1. RNA的测序
<1>一般过程：目的RNA的分离提纯→3’,5’末端分析→目的RNA降解为2套小片段，并分离各片段→片段测序→拼凑
<2>RNA的水解
碱水解：高温稀氨水可以将RNA彻底水解，水解位置在…Np↓Np↓…，产物为3’-NMP。
酶水解：
酶 类别 底物 特异性 产物
磷酸单酯酶PMase 外切酶 DNA、RNA ，见P141p↓N……N↓p 端点有游离的-OH

牛胰核糖核酸酶RNaseⅠ 内切酶 RNA 左边为Py，切点见P140-Pyp↓N- 3’端Py核苷酸具有游离的3’-○P
CMCT保护的RNaseⅠ 内切酶 RNA 左边为C，切点见-Cp↓N- 3’端C核苷酸具有游离的3’-○P
核糖核酸酶T1RNase T1 内切酶 RNA 左边为G，切点见P140-Gp↓N- 3’端G核苷酸具有游离的3’-○P
核糖核酸酶U2RNase U2 内切酶 RNA 左边为Pu，切点见P140-Pup↓N- 3’端Pu核苷酸具有游离的3’-○P
<3>RNA的末端分析，判断3’,5’末端核苷酸是什么。
5’末端分析：先用PMase去掉RNA端点核苷酸的游离磷酸根，露出-OH，再用多核苷酸激酶和放射性同位素P32（简记为γ- P32）标记过的ATP，将RNA5’末端核苷酸的5’位上
接上γ- P32，这样就把5’端核苷酸标记了。稀氨水彻底水解RNA，电泳，放射自显影，标准图谱，可知该核苷酸的种类。
3’末端分析：操作同上，在电泳图谱上找出核苷的位置。对照标准图谱，可知该核苷酸的种类。
<4>RNA片段测序：
将这个RNA片段的5’端进行标记（见<3>）
↓
4种RNA内切酶进行不同步的作用（解释:每个分子的作用位点都不同）
↓
电泳分离各产物
↓
放射自显影
↓
直读核酸序列
例如：
*AGCUAGCU…
5’-*多聚核苷酸长度 RNaseⅠ CMCT+ RNaseⅠ RNase T1 RNase U2 直读5’-
1 *A A
2 *AG *AG G
3 *AGC *AGC C
4 *AGCU U
5 *AGCUA A
6 *AGCUAG *AGCUAG G
7 *AGCUAGC *AGCUAGC C
8 *AGCUAGCU U
… … … … … …
思考题：
？
5’-*多聚核苷酸长度 RNaseⅠ CMCT+ RNaseⅠ RNase T1 RNase U2 直读5’-
1 *
2 *
3 * *
4 * *
5 * *
6 * *
7 *
8 *
… … … … …
2. DNA的测序
<1> DNA测序的一般程序：
DNA 限制性内切酶-----→ DNA片段(2套) 变性、电泳-----→ DNA单链 加减法、化学裂解法-----→ 片段定序 片段重叠法-----→ 拼凑DNA序列
<2>化学裂解法进行DNA单链片段定序
将这个DNA单链片段的5’端进行标记（同上）
↓
用4种特异性化学试剂进行不同步断裂（解释）
↓
电泳分离各产物
↓
放射自显影
↓
直读DNA序列
4种特异性化学试剂：断裂是通过破坏核苷酸来实现的。
硫酸二甲酯（DMS）：断裂对象是G，…G…
甲酸：断裂对象是嘌啉，A和G，…G…A…
肼：断裂对象是嘧啶，C和T，…C…T…
NaCl+肼：断裂对象是C，…C…
例如：
*AGCUAGCU…
5’-*多聚脱氧核苷酸长度 硫酸二甲酯（DMS） 甲酸 肼 NaCl+肼 直读5’-
0 * A
1 *A *A G
2 *AG *AG C
3 *AGC U
4 *AGCU A
5 *AGCUA *AGCUA G
6 *AGCUAG *AGCUAG C
7 *AGCUAGC U
… … … … … …
思考题：
？
5’-*多聚脱氧核苷酸长度 硫酸二甲酯（DMS） 甲酸 肼 NaCl+肼 直读5’-
0 *
1 *
2 * *
3 * *
4 * *
5 * *
6 *
7 *