二、生长测定（适用、注意事项）
直接计数法（全数）
间接计数法（活菌数）
测细胞物质量
三、细菌纯培养群体生长规律
将少量纯培养接种到一恒定体积的新鲜液体培养基中，适宜条件下培养，定时取样测定细菌含量，以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标，得繁殖曲线，对单细胞而言，又称生长曲线。
根据生长速率不同，分为几个时期。
（一）延迟期 lag phase(停滞期、调整期）
表现：不立即繁殖，生长速率近于0，菌数几乎不变，细胞形态变大。
特点：分裂迟缓，合成代谢活跃，体积增长快，对外界不良环境敏感。
原因：调整代谢，合成新的酶系和中间代谢产物以适应新环境。
消除：增加接种量；采用最适菌龄接种；培养基成分（种子、发酵）
（二）对数期 log phase
表现：代谢活性最强，几何级数增加，代时最短，生长速率最大。
特点：细菌数目增加与原生质总量增加，与菌液浊度增加呈正相关性。
代时（generation time）：单个细胞完成一次分裂所需时间，亦即增加一代所需时间。
G=t1-t0/n y=x•2n n=lgy - lgx/lg2
导出 G = t1 - t0 /3.3(lgy - lgx)
影响G因素：菌种、营养成分、营养物浓度（很低时影响）、培养温度。
（三）稳定期 stationary phase(最高生长期、静止期）
表现：新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，活菌数动态平衡。
特点：生长速率又趋于0，细胞总数最高。
原因：养分减少；有毒代谢物产生。
稳定期细胞内开始积累贮存物，此阶段收获菌体，也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段。
延长：补料，调pH、温度等。
此时，菌体总数量与所消耗的营养物之间存在一定关系，称为产量常数（生长效率）。Y = X - X0 /C 其中X-稳定期细胞干重/ml， X0 -接种时干重/ml，C-限制性营养物浓度。
根据这一原理，可进行生物测定。
将未知混合物加到只缺乏特定限制性营养物的完全培养基中，测定培养基所能达到的生长量，就可以计算出原混合物中特定限制性营养物的浓度。
（四）衰亡期 decline phase
表现：出现 “负生长 ”，有些细胞开始自溶。
对于丝状真菌，细胞数目不呈几何级数增加，无对数生长期，一般有调整期，最高生长期，衰退期。
四、连续培养 continuous cultivation
分批培养 batch culture ：将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。
若不断补充新鲜营养，并及时不断以同样速度排出培养物，则可延长对数期。
只要培养液的流动量能使增殖的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证总菌量不变，此即连续培养原理。
主要参数：D（稀释率）=F（流动速率）/V（容积）
连续培养方法
1、恒浊连续培养 turbidostat
不断调节流速使培养液浊度保持恒定。
装置
适用：收获菌体及与菌体相平行的产物。
2、恒化连续培养 chemostat
恒定流速，及时补充营养，营养物浓度基本恒定，从而保持恒定生长速率。又称恒组成连续培养。培养基成分中，必须将某种必需的营养物控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其它营养物过量。常用的有氨、氨基酸、葡萄糖、生长因子、无机盐等。
适用；科研
两种方法比较：
五、同步生长 synchronous growth
概念：使所有的细胞都能处于同一生长阶段，同时分裂的生长方式。
同步培养法获得：
（一）机械法（选择法）
1、离心沉降分离法
2、过滤分离法
3、硝酸纤维素薄膜法
（二）调整生理条件法（诱导法）
1、温度调整法：亚适生长温度-->最适生长温度培养。
2、营养条件调整法：控制浓度或组成，使细胞只能进行一次分裂。
3、用稳定期的培养物接种：稳定期细胞处于衰老状态，移入新鲜培养基，可得同步生长。
（三）抑制DNA合成法
DNA合成是细胞分裂前提。抑制一段时间再解除抑制。
3节：环境条件对生长影响
一、温度
影响两方面。
最低、最适、最高生长温度，致死温度。
微生物生长温度类型：
低温型（嗜冷微生物）
中温型（嗜温微生物）
高温型（嗜热微生物）
二、pH
主要影响：引起膜电荷变化，从而影响营养吸收；影响酶活性；改变营养物状态和有害物毒性。
有最适pH，此时酶活性最高，其他条件适合，生长速率最高，但不是生产的最适pH。
微生物细胞内的pH多接近于中性。
pH调节措施：
三、氧化还原电位 Eh
Eh与氧分压有关，也与pH有关。
不同种类微生物所要求的Eh不同。
Eh影响酶活性，也影响呼吸作用。
四、辐射
指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一个地方的能量。
（一）紫外线（非电离辐射）10-380nm
致死主要是细胞中很多物质对紫外线吸收。杀菌作用随剂量增加而增加。紫外线穿透力弱，应用于空气消毒、表面消毒、菌种诱变。
（二）电离辐射（X、α、β、γ）
效应无专一性， α、β穿透力较弱，X、 γ较强。
KI对电离辐射具保护作用。
五、干燥
水分对正常生长必不可少，各种微生物抵抗干燥能力不同。
六、渗透压
微生物对渗透压有一定适应能力。高渗溶液—质壁分离，低渗溶液—细胞膨胀破裂。
七、超声波（20，000Hz以上）
使细胞破裂，科研中破碎细胞。
八、表面张力
4.5--6.5x10-4 N/cm，降低影响。
4节：灭菌与消毒
灭菌 sterilization ：杀死所有微生物。
消毒 disinfection ：杀死一切病原微生物。
防腐 antisepsis：利用理化因素抑制微生物生长繁殖。
化疗 chemotherapy：利用具有选择毒性化学药物或抗生素来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗的一种措施。
第四章：微生物生长
生长：有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。
繁殖：单细胞-由于细胞分裂引起个体数目的增加。
多细胞-通过无性或有性孢子使个体数目增加的过程。
发育：适合条件下，生长与繁殖始终是交替进行的，从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程称为发育。
1节：微生物的发育周期
一、概念
发育周期、单细胞微生物、丝状真菌
二、发育周期中细胞学上变化
1、细胞壁与质膜的延伸
质膜合成位点在赤道带，细胞壁生长也定位在赤道区，并具有种的特异性。
2、DNA的复制
1）单向复制 John Cairns：E. Coli作材料，放射自显影技术。染色体从起始点开始，反时针旋转一周完成。
2）双向复制 Hiroshi Yoshikawa：不只按一个方向复制，起点与终点不重合。
3）滚环模型：不对称复制。一股线状，一股环状复制。
真核微生物复制有多个位点，都是双向。
3、发育循环中基因的表达
DNA的复制与细胞分裂是协调的。细胞分裂总是发生在DNA复制后的一定时间内。抑制DNA合成的各种化学处理或突变也抑制细胞分裂。细菌DNA复制需DNA起始蛋白作用。
E. coli 细胞分裂总是发生在DNA复制完成后大约20分钟，而DNA复制需40分钟，这样世代时间应是60分钟，但…...
三、细胞分化现象
在某些微生物的发育循环中，一个或一群细胞会从一种形态与功能转变为另一种形态与功能，此称细胞分化或形态发生。
2节：微生物纯培养的生长
一、纯培养的分离方法 表
二、生长测定（适用、注意事项）
直接计数法（全数）
间接计数法（活菌数）
测细胞物质量
三、细菌纯培养群体生长规律
将少量纯培养接种到一恒定体积的新鲜液体培养基中，适宜条件下培养，定时取样测定细菌含量，以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标，得繁殖曲线，对单细胞而言，又称生长曲线。
根据生长速率不同，分为几个时期。
（一）延迟期 lag phase(停滞期、调整期）
表现：不立即繁殖，生长速率近于0，菌数几乎不变，细胞形态变大。
特点：分裂迟缓，合成代谢活跃，体积增长快，对外界不良环境敏感。
原因：调整代谢，合成新的酶系和中间代谢产物以适应新环境。
消除：增加接种量；采用最适菌龄接种；培养基成分（种子、发酵）
（二）对数期 log phase
表现：代谢活性最强，几何级数增加，代时最短，生长速率最大。
特点：细菌数目增加与原生质总量增加，与菌液浊度增加呈正相关性。
代时（generation time）：单个细胞完成一次分裂所需时间，亦即增加一代所需时间。
G=t1-t0/n y=x•2n n=lgy - lgx/lg2
导出 G = t1 - t0 /3.3(lgy - lgx)
影响G因素：菌种、营养成分、营养物浓度（很低时影响）、培养温度。
（三）稳定期 stationary phase(最高生长期、静止期）
表现：新增殖细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，活菌数动态平衡。
特点：生长速率又趋于0，细胞总数最高。
原因：养分减少；有毒代谢物产生。
稳定期细胞内开始积累贮存物，此阶段收获菌体，也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段。
延长：补料，调pH、温度等。
此时，菌体总数量与所消耗的营养物之间存在一定关系，称为产量常数（生长效率）。Y = X - X0 /C 其中X-稳定期细胞干重/ml， X0 -接种时干重/ml，C-限制性营养物浓度。
根据这一原理，可进行生物测定。
将未知混合物加到只缺乏特定限制性营养物的完全培养基中，测定培养基所能达到的生长量，就可以计算出原混合物中特定限制性营养物的浓度。
（四）衰亡期 decline phase
表现：出现 “负生长 ”，有些细胞开始自溶。
对于丝状真菌，细胞数目不呈几何级数增加，无对数生长期，一般有调整期，最高生长期，衰退期。
四、连续培养 continuous cultivation
分批培养 batch culture ：将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。
若不断补充新鲜营养，并及时不断以同样速度排出培养物，则可延长对数期。
只要培养液的流动量能使增殖的新菌数相当于流出的老菌数，就可保证总菌量不变，此即连续培养原理。
主要参数：D（稀释率）=F（流动速率）/V（容积）
连续培养方法
1、恒浊连续培养 turbidostat
不断调节流速使培养液浊度保持恒定。
装置
适用：收获菌体及与菌体相平行的产物。
2、恒化连续培养 chemostat
恒定流速，及时补充营养，营养物浓度基本恒定，从而保持恒定生长速率。又称恒组成连续培养。培养基成分中，必须将某种必需的营养物控制在较低的浓度，以作为限制性因子，而其它营养物过量。常用的有氨、氨基酸、葡萄糖、生长因子、无机盐等。
适用；科研
两种方法比较：
五、同步生长 synchronous growth
概念：使所有的细胞都能处于同一生长阶段，同时分裂的生长方式。
同步培养法获得：
（一）机械法（选择法）
1、离心沉降分离法
2、过滤分离法
3、硝酸纤维素薄膜法
（二）调整生理条件法（诱导法）
1、温度调整法：亚适生长温度-->最适生长温度培养。
2、营养条件调整法：控制浓度或组成，使细胞只能进行一次分裂。
3、用稳定期的培养物接种：稳定期细胞处于衰老状态，移入新鲜培养基，可得同步生长。
（三）抑制DNA合成法
DNA合成是细胞分裂前提。抑制一段时间再解除抑制。
3节：环境条件对生长影响
一、温度
影响两方面。
最低、最适、最高生长温度，致死温度。
微生物生长温度类型：
低温型（嗜冷微生物）
中温型（嗜温微生物）
高温型（嗜热微生物）
二、pH
主要影响：引起膜电荷变化，从而影响营养吸收；影响酶活性；改变营养物状态和有害物毒性。
有最适pH，此时酶活性最高，其他条件适合，生长速率最高，但不是生产的最适pH。
微生物细胞内的pH多接近于中性。
pH调节措施：
三、氧化还原电位 Eh
Eh与氧分压有关，也与pH有关。
不同种类微生物所要求的Eh不同。
Eh影响酶活性，也影响呼吸作用。
四、辐射
指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一个地方的能量。
（一）紫外线（非电离辐射）10-380nm
致死主要是细胞中很多物质对紫外线吸收。杀菌作用随剂量增加而增加。紫外线穿透力弱，应用于空气消毒、表面消毒、菌种诱变。
（二）电离辐射（X、α、β、γ）
效应无专一性， α、β穿透力较弱，X、 γ较强。
KI对电离辐射具保护作用。
五、干燥
水分对正常生长必不可少，各种微生物抵抗干燥能力不同。
六、渗透压
微生物对渗透压有一定适应能力。高渗溶液—质壁分离，低渗溶液—细胞膨胀破裂。
七、超声波（20，000Hz以上）
使细胞破裂，科研中破碎细胞。
八、表面张力
4.5--6.5x10-4 N/cm，降低影响。
4节：灭菌与消毒
灭菌 sterilization ：杀死所有微生物。
消毒 disinfection ：杀死一切病原微生物。
防腐 antisepsis：利用理化因素抑制微生物生长繁殖。
化疗 chemotherapy：利用具有选择毒性化学药物或抗生素来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗的一种措施。
一、常用灭菌消毒方法
1、干热灭菌法
火焰灭菌（灼烧灭菌）、干热灭菌
2、湿热灭菌
巴氏消毒、煮沸消毒、高压蒸汽灭菌、间歇加热灭菌、实罐灭菌
3、过滤除菌
4、放射线灭菌
二、常用的消毒剂
理想的消毒剂：杀菌力强，使用方便；价廉；对人、畜无害；能长期保存；溶解度大；无腐蚀性等。
消毒剂种类：氧化剂、重金属盐、有机化合物
相对药效：
三、影响灭菌与消毒因素
1、微生物种类
2、培养基
3、消毒剂
4、环境因素
5节：化学疗剂对微生物作用
能直接干扰病原微生物的生长繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物。
化学疗剂能选择性地作用于病原微生物新陈代谢的某个环节，使其生长受到抑制或致死。
一、抗代谢物
结构上类似，竞争性地与酶结合，只有当正常代谢物量少或不存在时才起作用。
最常用的是磺胺类药物。是氨苯磺胺衍生物，其结构与对氨基苯甲酸（PABA）类似，而PABA是叶酸分子组成。叶酸是辅酶，在氨基酸、维生素合成中起重要作用，许多细菌需自己合成叶酸，而人和动物利用现成叶酸，因此不受磺胺干扰。
还有异烟肼rimifon，是吡哆醇对抗物。
二、抗生素
作用范围：抗菌谱
作用位点：
1、抑制细胞壁合成：青霉素，多氧霉素
2、影响细胞膜功能：多肽类，多烯类
3、干扰蛋白合成：抑制而非杀死
4、阻碍核酸合成：对细胞有毒
三、微生物抗药性
对药物的适应性即是抗药性。
抗药性主要表现（产生机制）
1、菌体内产生钝化或分解药物的酶
2、改变膜的透性而导致抗药性产生
3、被药物作用的部位发生改变
4、形成救护途径。
五章：微生物遗传
遗传heredity—亲代将其特有的生物学特性传递给子代。
遗传性—子代总保持与亲代相同的生物学特性。
遗传型genotype—生物体所具有的全套遗传物质总称。又称基因型。
表型phenotype—特定环境中生物体表现出的种种形态与生理特征。
变异variation— 遗传型的改变。
适应或饰变modification—表型的改变。
基因—指带有足以决定一个蛋白质全部组成所需信息的最短DNA片段。
菌株&克隆—指一组遗传型相同的细胞群。
微生物在遗传上特点：
1、微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。
2、很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。
3、对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。大多是无性生殖，变异易保留。
1节：遗传变异的物质基础
一、证明经典实验
（一）转化实验
1928，Griffith首次发现Streptococcus pneumoniae的转化现象。
1944，Avery等在离体条件下重复这一实验，并对转化本质进行了研究。
终于证明了DNA是遗传物质。
Griffith转化实验：
Avery转化实验
（二）噬菌体T2的感染实验
1952，Hershey & Chase 用E. coli, phage T2做材料，利用同位素示踪法进行实验。
蛋白质只含S不含P，DNA只含P不含S，分别用35S、32P标记E. coli, 用T2感染，得到35ST2、32PT2。
实验过程（插入）
（三）病毒拆开与重建实验
1956，Fraenkel & Conrat 用TMV（烟草花叶病毒）和HRV（霍氏车前病毒）进行实验，说明遗传信息在RNA中。
（插入）
二、遗传物质在细胞中存在方式
（一）细胞水平
（二）核水平（plasmid）
（三）染色体水平
（四）核酸水平
（五）基因水平（遗传功能单位）
（六）密码子水平（遗传信息单位）
（七）核苷酸水平（最低突变或交换单位）
染色体外遗传物质—质粒
染色体外，独立存在的，能自主复制的遗传物质。
双股环状DNA，可游离存在，也可整合到宿主DNA上。
吖啶类染料、高温、某些离子作用可消除质粒。
附加体episome：质粒插入到染色体上和染色体一起复制。
质粒种类
1、F因子（致育因子）：大肠杆菌中发现，含质粒为F+（♂）；无质粒为F-（♀）；质粒DNA整合到染色体上为Hfr.
2、R因子（耐药性）：痢疾杆菌，多价耐药性，耐药信息携带在质粒上。
3、Col因子（大肠杆菌素产生因子）
4、青霉素酶质粒
5、Ti质粒（诱癌质粒）：植物根癌，植物基因工程重要载体。
6、降解质粒：Pseudomonas
隐蔽质粒、表达质粒、分泌质粒等。 ←
2节：基因突变
突变mutation—遗传物质核酸中的核苷酸顺序突然发生了可遗传的变化。
包括基因突变（点突变）—由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起。
染色体畸变—DNA的大段变化现象，表现为插入、缺失、重复、易位、倒位。
由于重组或附加体等外源遗传物质的整合而引起的DNA改变，不属突变范围。
一、基因突变
（一）类型
按突变体mutant表型 特征不同
1、形态突变型：细胞或菌落形态改变。
2、生化突变型：代谢途径变异
营养缺陷型—由基因突变引起某酶合成能力丧失，必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能生长。
抗性突变型—能抵抗有害理化因素，包括抗药性、抗噬菌体等。
抗原突变型—细胞成分尤其是表面成分的细致变异。
3、致死突变型：基因突变导致个体死亡。
4、条件致死突变型：在某一条件下呈现致死效应，如温度敏感突变型。
如果从研究者能否从巨大群体中迅速检测和分离出个别突变体的目的来看，则只有两类突变：
选择性突变—具有选择性标记，可通过某种环境条件使它们得到优势生长，从而取代原始菌株。
非选择性突变—无选择性标记，而只有一些性状的数量差别，如菌落大小、颜色深浅、代谢物产量等。
（二）特点
1、不对应性：
突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。
相应的环境仅起着淘汰原有非突变型个体的作用，如果说其有诱变作用，也可以诱发任何性状的变异，而不是专一性地诱发一种变异。
2、自发性：
各种突变可以在没有人为的诱变因素下自发发生。
3、稀有性：
自发突变频率较低，一般10-610-9 。
突变率— 每个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。或每单位群体在繁殖一代过程中形成的突变体的数目。
一个细胞长大分裂成两个细胞的过程称为细胞世代。
细胞世代数=n-n0, 对于非同步生长来说，对数生长期，平均世代数= n-n0 /Ln2, m 为n-n0 期突变体数目，
突变率= m
n-n0 /Ln2
测定m的简单办法是将一细胞群体培养在平板上，让突变在平板培养中发生。这种情况下，每一突变产生一固定在原位的突变体克隆，经适当处理可以以单一菌落状态检出。
非选择性突变的突变率很难测定。
4、独立性：
突变的发生一般是独立的，某一基因的突变，既不提高也不降低其他基因的突变率。突变不仅对某一细胞是随机的，而且对某一基因也是随机的。
5、诱变性：
诱变剂作用可提高突变率。
6、稳定性：
遗传物质结构发生的稳定变化，因而产生的新性状也是稳定的，可遗传的。
7、可逆性
野生型突变型，为正向突变
野生型突变型，为回复突变（回变）。
（三）自发性与不对应性的证明
突变是通过适应而产生的，突变的原因与性状间是相对应的。
突变是自发的，与环境是不相对应的。
1、变量试验（1943，Luria & Delbruck）
实验要点：（插入）
结果：甲各皿抗性菌落数相差较大，乙各皿数基本相同。
说明：抗性突变不是由噬菌体诱导出来的。
如果是噬菌体诱导的话，结果会怎样？
突变发生在什么时间？
噬菌体起什么作用？
2、涂布试验（1949，Newcombe设计）
实验要点（插入）
说明：抗性突变发生在未接触噬菌体之前，噬菌体加入只起筛选作用。
如果不是这样，结果会怎样？
3、影印培养试验（1952，Lederberg设计）
影印培养法—使在一系列培养皿相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法。
利用此法可以从在非选择性条件下生长的群体中，分离出各类突变体。
实验要点：（插入）
结果：3上出现抗性菌落，在2上找出相应菌落接种到含药平板上，长出抗性菌落。而取与3上无对应关系的菌落接种到含药平板上则无生长。
（四）突变机制
1、诱变机制 induce mutation , mutagen
1）碱基对置换（点突变）
只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，分为转换和颠换。
①直接引起置换的诱变剂
可直接与碱基发生反应，不论在体内还是离体都起作用。包括亚硝酸、羟胺和各种烷化剂（硫酸二乙酯、NTG等）。
以HNO2为例：
HNO2 可使碱基氧化脱氨，使A→H，C→U，G→X。
AT→HeT HkC HkC
②间接引起置换的诱变剂
一些碱基结构类似物，但稳定性比正常碱基小，易发生互变。通过活细胞的代谢活动掺入到DNA中，只对正在生长发育的细胞有作用，即DNA复制时起作用。
主要是5-BU，5-AU，2-AP，8-NG等。
以5-BU为例：
AT A:5-BU(酮式） AT GC
AT G:5-BU(烯醇式） A:5-BU(酮式）
还可以看出5-BU掺入引起GC回复至AT的过程。
碱基对置换对密码子影响
简拼 UCG(Ser)（不表现突变现象）
错义 UAC(Tyr)
UCC 错义 UUC(Phe) (所合成蛋白质
(Ser) 有活性或纯化)
无义 UAA(终止符)（合成一些蛋白质碎片）
2）移码突变
由一种诱变剂引起DNA分子中一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部密码的转录和转译发生错误。也属于DNA分子的微小损伤。
主要是吖啶类染料，一系列ICR化合物。
在DNA链上增缺1、2、4、5碱基，可引起移码突变，增缺3、6，则不影响读码，只引起短的缺、增。
3）染色体畸变
DNA分子大的损伤。
①数量变化：真核有倍数性变化和非倍数性变化；原核只一条染色体，获得一段DNA，形成部分二倍体。
②结构变化：又分染色体内与染色体间畸变（非同源染色体间易位）。
4）转座因子 transposible element
1940`s B. McClintock 玉米遗传研究发现染色体易位。
在染色体组中或染色体组间能改变自身位置的一段DNA序列称作转座因子。
有三类：
插入序列 IS：0.7-1.4 kb，只能引起转座效应，不含其它基因。
转座子 Tn ：2-2.5 kb，含有几个至十几个基因。
Mu噬菌体：37 kb，含有20多个基因。
2、自发突变机制
Spontanous mutation：指微生物在没有人工参与下发生的突变。
1）背景辐射和环境因素的诱变：低剂量长期效应。辐射、高温、低浓度诱变剂。
2）自身代谢产物的诱变：H2O2—内源诱变剂。
3）互变异构效应：T、G酮式或烯醇式，A、C氨基式或亚氨基式。一般倾向于酮式和烯醇式。T以烯醇式与G配对，C以亚氨基式与A配对。
4）环出效应：DNA复制过程中偶尔环出。
（五）紫外线对DNA的损伤及机体对损伤DNA的修复
紫外线作用：同链DNA的相邻T间形成共价T二聚体，阻碍碱基间正常配对，从而引起突变或死亡。
机体对损伤DNA的修复：
1、光复活作用：经UV照射后的微生物暴露于可见光下，可明显降低起死亡率，此称光复活作用。
2、暗修复作用（切补修复）：与光无关，须4种酶参与：核酸内切酶、核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶。
3、重组修复：发生在DNA复制过程或复制之后，不切除DNA损伤部位的修复。DNA链在复制时，受损的模板作用消失，互补单链（新链）里留下空隙，产生诱导信号，recA基因被诱导，产生大量重组蛋白，与新链缺口结合，引起 子链和母链交换。交换后母链缺口，通过聚合作用，以对侧子链为模板合成DNA 片段填充，连接酶连接新旧链完成复制。
4、SOS修复 ：一种能够引起误差修复的紧急呼救修复，是在无模板DNA 情况下合成酶的诱导修复。正常情况下无活性有关酶系，DNA受损伤而复制又受到抑制情况下发出信号，激活有关酶系，对DNA损伤进行修复，其中DNA多聚酶起重要作用，在无模板情况下，进行DNA修复再合成，并将DNA片段插入受损DNA空隙处。
5、DNA 多聚酶的校正作用：DNA 多聚酶除了对多核苷酸的多聚作用外，还具有3`到5`核酸外切酶作用，依靠这一作用，能在复制过程中随时切除不正常的核柑酸。
上述修复中前3种属无错误修复，使诱变作用降低。而SOS修复属易误修复，造成误差修复，引起突变。
3节：突变与育种
菌种工作包括三方面：选种、育种、复壮和保藏。
选种—从自然界和生产中选择符合需要菌种。
育种—进一步提高已有菌种某种性能，使更符合要求。
选育新菌种可从几方面着手：
1）从原有菌株入手进行各种遗传改造工作。
2）根据文献资料报导的微生物种属，向国内外菌种保藏机构索取同种或同属菌株，从中寻求符合要求者。
3）根据所需菌种特性、嗜好或工艺要求，从特定的生态环境中以特定方法重新分离自然菌株。
（一）从自然界分离菌种（菌种分离与筛选）
一般步骤：（插入）
一、采样
主要以土壤为样品，一般采5-20cm深处土，须记录日期、地点、环境情况等。要根据筛选目的、微生物分布、菌种特性以及与之有关的环境，综合考虑，具体分析来决定。
二、增殖培养（富集培养）
实际上是初筛浓缩，方法主要是：
1、控制营养成分；2、控制培养条件。
菌种筛选主要步骤
调查研究及查阅充分的资料
↓
设计实验方案
↓确定采集样品的生态环境
采样
↓确定特定的增殖条件
增殖培养
↓确定特殊的选择培养基及可能的
↓定性或半定量快速检出法
平板分离
↓
原种斜面
↓确定发酵培养基础条件
筛选
↓
初筛（1株1瓶）
↓
复筛（1株3～5瓶）
↓结合初步工艺条件摸索
再复筛（1株3～5瓶）
↓
3～5株
↓
单株纯种分离
↓ 生产性能试验
↓→毒性试验
菌种鉴定
三、分离
目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速，有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常用平皿反应法：
纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。
透明圈法：混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。
变色圈法：直接用显色剂或指示剂。
生长圈法：利用某些具有特殊营养要求的微生物作为工具菌，要分离的微生物能在一般培养条件下生长而合成该营养物而使工具菌能生长，形成生长圈。
抑制圈法：琼脂块培养法。
四、筛选
即进行生产性能测定，确定适合生产要求菌种。
一般初筛、复筛、再复筛，少数几株进行全面考察。
筛选时培养条件确定是关键，培养基组成、通风、pH、温度等应根据菌株性能、产物代谢途径、类似产品的培养条件及前人的工作进行综合考察，慎重选定。
初筛一株一瓶，取其中10-20%复筛，一株3瓶，直至最后3-5株，广泛考察。
（二）自发突变与育种
一、生产育种
二、定向育种
用某一特定环境长期处理某一微生物群体，同时不断地进行移种传代，以达到积累和选择合适的自发突变体的一种古老育种方法。
近年发展代谢类似物的梯度培养皿法。
（三）诱变育种
利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后设法采用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株，以供生产科研之用。
基本工作步骤：
基本步骤
原种 （出发菌株） → 纯化→斜面→同步培养→离心洗涤→振荡打散→过滤→菌悬液
→诱变处理 → 平板分离 → 斜面 → 斜面→ 斜面 →保藏及扩大试验
（活菌计数） （计数） （变异率）（初筛） （复筛） （再复筛）
一、出发菌株的选择
用作出发菌株有：野生型菌株；生产菌株；经过诱变的菌株。
一般要求生长快，营养要求粗放，发育早，产孢子多，对诱变剂敏感性高，已能积累少量产品或前体物的菌株。
二、菌悬液制备
一般采用单孢子或单细胞悬液。
诱变剂一般只作用与DNA的一条链，发生变异无法反映在当代表型上，只有经过DNA复制和细胞分裂后，才会使表型发生变异，此即表型延迟。
制备菌悬液时要注意生理状态、均一性、细胞浓度、菌悬液介质（生理盐水或缓冲液）。
三、诱变处理
1、常用诱变剂：
物理诱变剂：紫外线（UV）、X射线、r射线、快中子（0.2-10Mev）。
化学诱变剂：硫酸二乙酯DES，甲基磺酸乙酯EMS，亚硝基胍NTG。
总结表
2、诱变剂量：
诱变剂作用：提高突变率；扩大产量变异幅度；使变异朝正变或负变方向移动。
凡是在高诱变率基础上，既能扩大变异幅度，又能使变异移向正变范围的剂量就是合适剂量。图8-21
3、处理方法：
采用复合处理，包括诱变剂先后使用，同时使用和重复使用，提高效果。
表8-8
四、变异菌株的分离和筛选
诱变处理后一般要经过后培养和变异株筛选。
一般将筛选分为初筛和复筛。
初筛重点在于分离培养尽可能多菌株，采用预先设计的相同培养条件，以量为主，准确性其次，减少漏筛机会。
复筛以质为主，反复多次。
高效筛选方案：
寻找利用和创造形态、生理与生产性状间的相关性。
筛选抗生素生产菌时，可采用琼脂块培养法：图8-22
（四）营养缺陷型筛选
基本培养基（MM，[—]）：凡能满足某一菌种野生型和原养型菌株营养要求的最低成分的组合培养基。
完全培养基（CM，[+]）：在基本培养基中加入一些富含生长因子的物质，以满足该微生物各种营养缺陷型要求。
补充培养基（SM，[X]）：在基本培养基中有针对性地加上某一种或几种其自身不能合成的成分，以满足相应营养缺陷型生长的培养基。
营养缺陷型表示：所要求的营养物的头三个字母表示，如bio-，对应的野生型以bio+表示。
一般步骤：
1、诱变处理
2、淘汰野生型：抗生素法、菌丝过滤法。
3、检出缺陷型：方法有
1）夹层培养法：图8-23。
2）限量补充培养法：含微量蛋白胨（0.01%）的[一]上。
3）逐个检出法：分别接种到[—]和[+]上。
4）影印接种法：[+]培养，影印至[—]上。
4、鉴定缺陷型：
1）生长谱法：缺陷型斜面培养后，制成菌悬液涂布于[—]上，平板上划成不同区域，分别加上一种所需测验的营养物，培养观察。
2）组合补充培养基法：菌株较多时用。
营养缺陷型应用
1、标记菌种：代谢途径、杂交、基因重组中。
2、生物测定用菌
3、生产菌株：前体积累。
（五）抗性突变株筛选
1、一次性筛选：在对于出发菌株完全致死的环境中一次性筛选少数抗性突变株。
2、阶梯性筛选：使用浓度梯度与某一空间或时间。
空间—梯度培养皿法：图8-18。
时间—类似于驯化。
4节:基因重组与杂交育种
杂交hybridization：两个性状不同的菌株或变种之间进行细胞结合，遗传物质交换重新组合成新的性状。
基因重组gene recombination：两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子的重新组合后，形成新遗传型个体的方式。
二者关系
一、原核微生物的基因重组
（一）转化 transformation
概念：受体菌直接吸收了来自供体菌的DNA片段，通过交换，把它组合到自己的基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象。
转化后的受体菌，称转化子transformant
DNA—转化因子。
条件：
1、能进行转化的细胞必须是感受态的。即受体菌最易接收外源DNA片段并实现转化的生理状态。
2、DNA一般都是线状双链DNA，不小于5×105D，转化的片段小于107D，平均含15个基因。
转化频率较低，一般0.1~1%。
过程：图8-25
双链DNA结合→酶促分解、形成片段→一条单链降解，一条进入→同源配对、受体相应段切除，交换，杂种DNA→复制、分离、转化子。
图8-26
转化育种：DNA提取，感受态细胞培养和转化。
转染：把噬菌体或其他病毒DNA（RNA）提取出来，用它去感染感受态的宿主细胞，并产生正常噬菌体或病毒后代。
（二）转导transduction
概念：通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象。
U型管实验：两株营养缺陷型LA-22（try-)，溶源性细菌（受体）；LA-2（his-），敏感菌（供体）；温和性噬菌体P22。结果在LA-22端出现原养型his+try+。原因？
1、普遍转导
噬菌体可误包裹供体菌中任何基因（包括染色体外遗传物质），并使受体菌实现各种性状的转导。
1）完全普遍转导：
噬菌体误包入供体菌DNA片段，形成完全不含本身DNA的假噬菌体（一种完全缺陷噬菌体），感染受体菌后，受体不会溶源化，也不会裂解。导入的DNA片段与同源区配对，通过两次交换而重组到受体菌DNA上，形成稳定转导子。
2）流产普遍转导
在获得供体菌DNA片段的受体菌内，如果转导的DNA不能进行重组和复制，其上的基因仅经过转录而得到表达。
此外源DNA能够保持下去，任何时候只有一个细胞含有它。表型上仍 出现供体菌特征，能在选择性培养基上形成微小菌落。
2、局限转导
通过某些部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因转移到受体菌中的转导现象。
产生机制：不正常切割 图8-30
温和噬菌体整合到细菌DNA特定位点上，诱导裂解时，在插入位点两侧的少数宿主基因会因偶尔发生的不正常切割而连在噬菌体DNA上，一起包入噬菌体中，形成部分缺陷噬菌体，无正常噬菌体的溶源性和增殖能力。
Compbell模型
（1）低频转导（LFT）
E. coli k12的 phage 成熟时，产生转导噬菌体（ dgal） 频率为10-4--10-6 ，称低频转导。LFT 裂解物在低moi 下感染宿主，可得极少量局限转导子。
dgal— 带有半乳糖基因的 缺陷噬菌体。
（2）高频转导（HFT）
E. coli gal-受体菌用高moi的LFT裂解物进行感染时，则凡感染有 dgal 的 细胞，几乎同时感染有正常 。
两种噬菌体可同时整合到受体菌DNA 上，使其成为双重溶源菌 ，诱导裂解时，正常 可补偿 dgal 所 缺失基因功能，两个噬菌体同时复制，产生裂解物中，大体上含等量 和 dgal。 用低moi 的HFT 裂解物感染宿主，可高频率转导。
3、溶源转变 lysogenic conversion
当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主基因上，而使后者获得了除免疫性以外新性状的现象，称溶源转变。
与转导本质上不同，噬菌体不携带任何供体菌基因，是完整的，而非缺陷的。
普遍转导与局限转导比较(插入)
（三）接合conjugation
概念：通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程。也称杂交。
基本原理：
细菌、放线菌中都存在接合现象。放线菌中天蓝色链霉菌( Streptomyces coelicolor)研究的最为详细。细菌中，大肠杆菌研究最清楚。
F+ + F- = F+
F因子传递过程—滚环模型：
Hfr + F- = F-
与F-接合时， Hfr染色体在F因子处发生断裂，环状变成线状，转移至 F- 约100分钟，F因子最后转移。转移过程中经常会发生断裂，所以重组频率高，但很少出现F+ 。
转移过程与F因子传递过程基本相同，但进入F- 的单链DNA经双链化后，形成部分合子，然后同源配对，经过两次或以上的交换才能发生重组。
中断杂交实验
Hfr染色体转移有严格的顺序性，实验中可每隔一定时间利用强烈搅拌等措施，中断接合，从而获得呈现不同数量Hfr性状的F- 接合子。
根据在F- 中出现Hfr各种性状的时间早晚，可以画出一幅较完整的环状染色体图。
F` 菌株—Hfr菌株的F因子因不正常切割而脱离染色体时，可形成游离的但带有一小段染色体基因的F因子，称为F`因子。
此带有F`因子的菌株—初生F`菌株。
初生F`+ F- =F`（次生F`菌株）
既获得了F因子，又获得了来自初生F`菌株的若干遗传性状，以这种接合来传递供体菌基因的方式，称F因子转导。（F—duction）
次生F`菌株中，一部分F因子可重新整合到染色体上，恢复成Hfr菌株。
接合育种
育种前所选择的亲本必须具有一定的选择性标记，还必须具有F因子，受体菌无F因子，但必须为F因子可亲和。
1、菌株准备
2、杂交
3、重组体检出
（四）原生质体融合 Protoplast Fusion
通过人为方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，又称细胞融合。
一、特点
1、杂交频率高
2、受接合型或致育性限制较少，但与亲缘性有一定关系。
3、遗传物质传递更完整。
4、存在两株以上亲株同时参与融合可能。
5、可以采用产量性状较高菌株作融合亲株。
6、提高生产性状的潜力较大。
7、原生质体较容易进行转化，可用于工业微生物育种工作
二、主要步骤
1、原生质体制备：
作为育种菌株须：①具有良好生产性状②具有一些稳定的明显的遗传标记。
一般采用双标记，避免回复突变干扰。离心收集对数后期菌体，破壁。原生质体低渗中易破裂，使用渗透压稳定剂进行保护。（甘露醇、山梨醇、蔗糖、氯化钾、氯化钠等）
离心收集原生质体。
2、原生质体融合：
加入促融合剂—聚乙二醇（PEG）及Ca2+、Mg2+，使原生质体表面形成电极性，相互易于吸引，形成聚集物。UV、电场、激光等技术可应用。
3、再生成正常细胞：
融合后的原生质体不具细胞壁，不能在普通培养基上增殖，无法表现，必须使其重新形成壁。再生培养基必须具有与原生质体体内相同渗透压，常用含Ca2+、Mg2+及渗透压稳定剂的完全培养基。
检出融合细胞。
外源基因命运
1、具备复制的必要因子，能在受体细胞中坚持下去并进行复制，发展成部分二倍体无性系。
2、流产转导。
3、被酶解—寄主限制。
4、重组。
二、真核微生物基因重组
（一）有性杂交
一般指性细胞间的接合和随之发生染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。
常见有性孢子。
（二）准性生殖parasexual reproduction
类似于有性生殖但更为原始的一种生殖方式。可使同一生物的两个不同来源的体细胞经融合后，不通过减数分裂而导致低频率的基因重组。
主要过程：图8-37
1、菌丝联结、质配。
2、形成异核体。
3、核配。
4、体细胞交换和单倍体化。
体细胞中染色体交换—有丝分裂交换：双倍体杂合子遗传性状不稳定，进行有丝分裂过程中，极少数核中染色体会发生交换和单倍体化，而形成具有新性状的单倍体杂合子。
有性生殖与准性生殖区别：表8-12
准性杂交
主要步骤：图8-38
1、选择亲本：要有选择性标记。
2、强制形成异核体。
3、移单菌落。
4、检验稳定性。
5、促进变异。然后筛选。
归纳总结：表8-10
基因工程 gene engineering
5节：菌种衰退、复壮和保藏
一、衰退与复壮
对产量性状而言，菌种的负变就是衰退，其他原有典型性状变得不典型了，也是衰退。
一个重要原因是基因突变，与控制生产性状有关的基因负变造成生产性状劣化。培养、保藏条件等也有影响。
（一）衰退的防止
1、控制传代次数；
2、创造适宜的培养条件；
3、利用不同类型细胞进行接种传代；
4、采用有效的菌种保藏方法，加强菌种管理措施。
（二）复壮
1、纯种分离
2、通过宿主体进行复壮（寄生性微生物）
3、淘汰已退化个体
二、菌种保藏
首先挑选典型优良纯种，其次创造一个有利于休眠的环境条件，还要考虑方法的通用性与简便性。
1、低温保藏：冰箱、超低温。
2、干燥保藏：土壤、细砂、硅胶等。
3、隔绝空气保藏：石蜡油封。
4、冻干保藏：综合低温、干燥、真空。
5、活体保藏：病原微生物、病毒。
实验室常用方法：
菌种保藏机构简介
中国微生物菌种保藏管理委员会CCCCM
1、普通微生物菌种保藏管理中心
中科院北微所（AS）：真菌、细菌
武汉病毒所（AS-IV）：病毒
2、农业微生物菌种
农科院土肥所（ISF）
3、工业微生物菌种
食品发酵所（IFFI）
4、医学微生物菌种
医科院皮研所（ID）：真菌
卫生部检定所（NICPBP）：细菌
医科院病毒所（IV）：病毒
5、抗生素菌种
医科院医药生物技术所（IA）
四川抗研所（SIA）：新抗菌种
华药抗研所（IANP）：生产菌种
6、兽医微生物菌种
农业部兽医药品监察所（CIVBP）
中国典型培养物收藏中心（武汉大学）
国外
美国典型菌种收藏所（ATCC）
美国农业部北方地区研究室（NRRL）
日本大阪发酵研究所（IFO）
荷兰真菌中心收藏所（CBS）
法国里昂巴斯德研究所（IPL）
西德柯赫研究所（RKI）
苏联科学院微生物研究所（IM）
六章：微生物生态与环境保护
（自然条件下的微生物）
生物圈 biosphere ：地球上有生命活动的范围，是地球上全部生活有机体与其环境相互作用的统一整体。是所有生态系统的总和。
微生物生态：研究处于环境之中的微生物，和与微生物相联系的物理、化学和生物等环境条件，以及它们之间的关系。
生态系 ecosystem ：生物与其生境通过能量流动和物质循环所组成的一个整体结构。生物群落是核心。
1节：自然界中的微生物
一、土壤中微生物
土壤是自然界最适宜微生物生长的环境，具有微生物所需一切营养物及各种条件。种类主要是异养型种类。
二、水中微生物
种类和数量要比土壤中少得多。
淡水中微生物主要来源于土壤、空气、污水或死亡腐败的动植物体。海水中微生物总量超过陆地。
饮用水标准：每ml水细菌总数不超过100个，E. coli每升水不超过3个。
三、空气中微生物
空气非微生物生长良好环境。微生物通过各种方式传入空气，又随风传播。
数量取决于环境。
潮湿空气中微生物比干燥空气中少，因为潮湿空气中微生物被小水滴带着沉降下去了。
空气中菌数测定：过滤收集，培养计数。
四、极端环境微生物
了解这些微生物，可以利用其特殊基因、机能，创造有用新种。
2节：微生物间以及与其他生物间的关系
生物间关系：
一、微生物间关系
1、互生：较松散联合，可以是一方得利，或双方有利。（混菌培养）
2、共生：紧密结合在一起，高度发展时，形成特殊共住体，生理上有分工，组织、形态上产生新结构。
地衣：藻类 + 真菌
3、寄生：一种生物生活在另一种生物表面或体内，从后者获得营养。
4、拮抗：一种生物产生不利于另一种生物生存的代谢物质或改变环境条件，抑制甚至杀死另一种生物的现象。
5、捕食：一种生物直接吞食另一种生物。
二、与高等植物关系
共生：根瘤菌，菌根菌
互生：根际微生物
寄生：植物病原微生物
三、与人及动物关系
共生：瘤胃微生物，白蚁
互生：人体肠道正常菌群
寄生：病原微生物，寄生于昆虫（生物杀虫剂）
择生生物（悉生生物）：接种有一种或多种已知微生物的无菌动物。
3节：微生物与自然界中的物质循环
物质循环：一切生物将所需重要化学元素自非生命物质状态转变为有生命的物质状态，再自有生命的物质状态转变为非生命的物质状态，如此循环不已。
微生物既是分解者、消耗者，又是生产者。
一、碳素循环
微生物作用：1）光和作用 2）分解作用
大气二氧化碳（0.02%）约6000亿吨，植物光合作用年消耗600到700亿吨，燃烧年产生50～60亿吨，人和动物呼吸产生的二氧化碳仅够植物光合作用一个月之需，90%二氧化碳由微生物代谢活动产生。
经光合作用固定地二氧化碳，大部分以聚糖形式累积在木本、草本内。
二、氮素循环
分子态氮、有机态氮、无机态氮
图9-6。微生物作用：固氮、硝化、反硝化、氨化、氨同化
三、硫素循环
元素态、无机化合态、有机态
图9-7。微生物作用：脱硫、硫酸盐还原作用（同化性、异化性）、硫化（无机硫氧化）。
四、磷素循环
自然界无机磷主要是磷酸钙，有机磷主要是核蛋白、核酸、卵磷脂等，都是非溶性的。
转变为可溶性，主要是微生物作用。
4节：微生物与环境保护
当有害物质浓度超过了生态系统的净化能力时，就会造成对生态系统结构和机能的破坏，打破生态系统的平衡，使人类生活的环境发生变化，此即环境污染。
一、微生物对污染物的降解与转化
1、主要污染物
无毒有机物:易被生物降解;
有毒有机物:不易被生物降解。
无毒无机物:一些营养性无机盐;
有毒无机物:重金属等Hg As Pb Cd。
2、微生物的降解与转化
对无机污染物的转化
微生物不能降解重金属，只能使它们发生形态之间的相互转化及分散和富集过程。也就是改变金属在环境中的存在转态，从而改变它们的毒性
有机Hg Pb 无机Hg Pb
对有机污染物的降解
农药：主要通过催化作用使农药分子发生一些结构改变，使其被分解。
石油：多种烃类混合物，多种微生物共同作用，
二、水污染及防治
1、水的污染源
污染指标：
COD（化学需氧量）：使用强氧化剂（高锰酸钾、重铬酸钾）使1L污水中的有机物进行化学氧化时所消耗的氧的毫克数。mg/L
BOD5(五日生化需氧量)：20℃时，每L废水所含有机物在5天内进行微生物氧化时所消耗的氧量，mg/L。
2、处理废水的微生物法
(1) 厌氧处理法（产能型）
采用厌氧消化器把微生物可降解的有机物转化成甲烷、二氧化碳、水和其它气体的一种处理方法。
过程：三个阶段，图9-11:涉及到的微生物，发生的反应。
(2) 好氧处理法
过程
①活性污泥法（曝气法）（耗能型）：利用含有好氧微生物的活性污泥，在通气条件下，使污水净化的生物学方法。
活性污泥是一种絮状污泥，主要是菌胶团形成菌，原生动物，有机和无机胶体以及悬浮物组成。人工培养、驯化获得。
根据污水在系统中流动状况分为推流式和完全混合式。
②生物膜法：以好氧微生物组成的生物膜为净化主体的生物处理方法。
A、滴滤池法（节能型）（洒水滤床法）
B、生物转盘法（耗能型）
③氧化塘法（节能型）（稳定塘）：大面积敞开式污水处理池，利用藻菌互生系统来分解有机物，使污水得以净化。
固体废物采用堆肥法和沼气发酵法。
七章：传染与免疫
1节：传染 infection
非传染性：生理性、遗传性等
疾病 病原微生物（病毒、细菌）
传染性
其它生物（寄生虫等）
传染是病原微生物侵入机体后，在机体一定部位生长繁殖，并引起一系列病理生理的过程。
传染是宿主、病原菌、环境因素三方面力量作用的结果。
一、传染的三种可能结局
1、隐性传染
2、带菌状态
3、显性传染
传染病专指显性传染。
二、决定传染结局的三个因素
（一）病原微生物在传染免疫中作用
要造成感染，必须能抵抗机体内的天然防御机能而不被消灭，并在侵入体内后能生长繁殖，扰乱机体的新陈代谢，造成传染。
要具备一些条件才能传染（P320）
1、毒力或致病性
某种微生物对一定宿主，在一定条件下引起疾病的能力。
强弱取决于以下因素：
1）侵袭力：与酶（卵磷脂酶、透明质酸酶、胶原酶、链激酶、凝固酶）和微生物结构（荚膜、菌毛、表面抗原）有关。
2）毒素
①内毒素：多由G-产生，化学组成为脂多糖。
②外毒素：某些G+分泌到体外的毒性物质，化学组成为蛋白质。如破伤风毒素、肉毒毒素、白喉外毒素等。
外毒素可用0.3-0.4%甲醛脱毒，成为类毒素（仍保持抗原性）。
内、外毒素比较：P322，表10-1
2、数量
与毒力强弱有关。多数病原微生物需要足够数量侵入机体，才能发病。
3、侵入途径
不同菌侵入途径不同，只有侵入易感机体的一定部位，才能发病。
（二）机体在传染免疫中作用（宿主的免疫力）
1、免疫定义 Immune
机体对体内外生物性刺激的反应，在正常情况下机体识别异物、排除异物、消灭异物的生理功能。
或者说机体识别自己、排除异己抗原物质的一种生理功能。
既有有利一面，也有有害一面。
2、免疫反应分类
1）非特异性免疫与特异性免疫
非特异性免疫是机体对所有病原微生物都有防御作用，没有特殊的选择性。它受遗传控制，是机体在长期的种系发育与进化过程中逐渐建立起来的一系列防卫机能，在个体一出生就具有。
又称天然免疫（先天免疫）
特异性免疫是指机体针对某一种或某一类微生物或其产物所产生的特异性抗力。
是个体在生活过程中通过隐性感染或预防接种等方式，使抗原与免疫系统的细胞相接触后而获得的防卫机能。又称后天获得性免疫
2）自动免疫与被动免疫
自动免疫是指用人工方法注射抗原（菌苗、疫苗、类毒素），使机体产生免疫功能。
被动免疫是指用人工方法注射抗体（抗毒素、抗血清）而产生对病原体的抵抗力。
3）细胞免疫与体液免疫
细胞免疫是指致敏淋巴细胞与其相应抗原作用所产生的特异性免疫。
体液免疫是抗体的免疫作用。
3、免疫的功能
1）生理防御功能（免疫防御）
2）自身稳定功能（免疫稳定）
3）免疫监视作用(及时排除突变细胞。)
（三）环境因素
P325表解
2节：非特异性免疫
一、机体的天然屏障作用
1、皮肤和粘膜（体外屏障）
2、内部屏障
二、吞噬细胞
白细胞分类：P327，表10-4，图10-1
1、噬中性粒细胞：吞噬过程。图10-2
2、巨噬细胞：来源、功能。
三、炎症反应
四、体液因素（正常体液中的抗微生物因素）：P330，表10-5
1、补体系统
补体是存在于正常血清中一组具有酶活性的蛋白，有补充抗体作用能力，其作用无特异性，可与抗原抗体复合物作用，不能单独作用于抗原或抗体。补体由巨噬细胞、肠上皮细胞及肝、脾细胞产生。
补体系统由11个血清蛋白构成，C1-C9，C1又分C1q、C1r、C1s。是一组酶原，被激活后发挥作用。
补体攻击细胞结果，使膜损伤，导致细胞裂解。促进吞噬作用。与变态反应有关。
(2)干扰素 interferon IFN
干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的蛋白质，其活性发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及到RNA和蛋白质合成。
人干扰素有α干扰素（白细胞干扰素），β干扰素（成纤维细胞干扰素），γ干扰素（免疫干扰素）。
干扰素诱生剂：P331
天然干扰素是分子量为2万的糖蛋白，其作用无特异性，但产生干扰素的动物和被保护的动物之间却有种属特异性。不过也有交叉保护作用。干扰素作用时间短，仅几天。
作用机制：P331,图10-3
主要抑制病毒的复制，其可激活宿主DNA,产生抗病毒蛋白（AVP)，与核糖体作用，使其只能合成宿主蛋白，而不能合成病毒蛋白。
3节：特异性免疫
一、参与特异性免疫的组织器官
胸腺、腔上囊、骨髓、淋巴结、脾脏。前三者称中央淋巴组织，后二者称外周淋巴组织。
二、参与特异性免疫的细胞
免疫活性细胞是指在免疫过程中受抗原刺激后能进行分化、增殖并发生特异性免疫应答的T、B细胞。
免疫细胞主要是各类淋巴细胞、巨噬细胞等
免疫细胞均来源于骨髓干细胞。
1、干细胞：分化图 P336，图10-5
2、T淋巴细胞（胸腺依赖淋巴细胞）
T细胞发育过程（细胞免疫）
T细胞表面标志：绵羊红细胞（sRBC)受体、有丝分裂原受体等。
T细胞分类：
T调节细胞 辅助性T细胞(TH)
(TR) 抑制性T细胞（TS)
T效应细胞 迟发型超敏T细胞(TD)
(TE) 细胞毒T细胞(TC)
2、B淋巴细胞（骨髓依赖淋巴细胞）
发育过程:体液免疫
标志：膜表面免疫球蛋白SmIg。
还有一些淋巴细胞，如K细胞、NK细胞等。
3、巨噬细胞
在特异性免疫中，淋巴细胞不易直接接触抗原，须经巨噬细胞吞噬消化，将抗原信息传递给淋巴细胞。此外，巨噬细胞还能释放白细胞介素-1，参与免疫。
三、特异性体液免疫
由抗体介导的免疫
1、中和外毒素
2、调理作用
3、凝集作用
4、阻止病原菌对粘膜的吸附
四、特异性细胞免疫
致敏T淋巴细胞介导的
1、 TD细胞的作用：释放淋巴因子，其作用于免疫活性细胞而产生免疫效应。
主要的淋巴因子：表10-8
淋巴因子作用无特异性，但其释放需特异性抗原刺激。
2、 TC 细胞作用：能特异性地识别靶细胞表面抗原，与其结合，使其溶解。
非特异性免疫与特异性免疫关系
免疫应答（immune response）：从一个抗原刺激开始，机体内抗原特异性淋巴细胞识别抗原（感应）后，发生活化、增殖和分化，表现出一定的体液免疫和细胞免疫的效应的过程。
分三阶段，两种类型。
4节：抗原与抗体Antigen and Antibody
一、抗原
（一）定义：一类能刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质，具有一定的化学结构、物理及生物学特性，并具有免疫原性（抗原性）和反应原性。
免疫原性：刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的免疫应答能力。
反应原性：能和特异性抗体或致敏淋巴细胞结合，发生特异性反应的能力。
（二）种类
1、完全抗原：具有抗原性和反应原性
2、半抗原：只有反应原性，没有抗原性。
（三）性质
（免疫原性的物质基础）
1、异物性
1）异种间物质
2）同种异体间物质：ABO血型，移植排斥。
3）自体隔绝成分
4）自体组织蛋白变性，成为自身抗原。
2、一定的物化特性
1）大分子物质
2）一定的结构
3）特异性：由分子表面上的特定化学基团——抗原决定基所决定的。半抗原实际上就是抗原决定基。任何抗原都可看成是一个载体与半抗原的复合物。
（四）微生物抗原结构
鞭毛抗原（H抗原）
菌体抗原（O抗原）
表面抗原：如荚膜抗原
外毒素和类毒素
二、抗体
（一）定义：由抗原刺激机体的B细胞，由B细胞转化成浆细胞所产生的具有特异性的免疫球蛋白。Immunoglobulin Ig
抗体在体外可与相应抗原作用产生可见反应——血清学反应；在体内可起抗传染作用。
（二）种类
IgG, IgM, IgA, IgE, IgD.
（三）结构
5种Ig结构基本上相似。
单体由4条多肽链组成，两条长链称重链（H链），两条短链称轻链（L链），呈Y字形，链间由二硫键相连。
P344，图10-11
不变区（C区）与可变区（V区），枢纽区，抗原结合在V区。
木瓜蛋白酶水解IgG，可得3个片段，2个相同片段称Fab（抗原结合片段），1个片段称Fc（可结晶片段）。
因此1个Y字抗体有2个抗原结合点，是两价抗体。
胃蛋白酶、巯基试剂水解产物
五类抗体性质及特性（补充讲义）
（四）抗体形成一般规律
1、初次反应与再次反应：图10-17
2、回忆反应
3、几类抗体出现顺序
（五）抗体形成机理
P350 表解
1、诱导学说（模板学说）
2、无性繁殖系选择学说 P352，图10-18
3、抗体多样性分子生物学机制
（六）淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体
1、多克隆抗体及缺点
2、淋巴细胞杂交瘤技术建立 图 10-20
3、单克隆抗体应用
三、抗原抗体反应
（血清学反应）
(一）抗原抗体结合的一般特点
1、高度特异性
2、是分子表面结合
3、需要合适的比例（区域现象）
4、反应分两个阶段
1）特异结合阶段
2）可见反应阶段
（二）反应组成成分
1、抗原
2、特异抗体
3、环境因素
基本因素：需电解质、温度、pH等。
特殊因素：有的需补体、白细胞。
（三）反应类别
1、沉淀反应
抗原、抗体都处于溶解状态，按适当比例混合后，在电解质、温度适合的条件下，产生沉淀现象。
抗原称沉淀原，抗体称沉淀素。
实验方法有玻片法、试管法、环状试验、琼脂扩散法、免疫电泳
2、凝集反应：
颗粒性抗原与其特异性抗体在有电解质情况下，结合成可见凝集块。
抗原称凝集原，抗体称凝集素。
与沉淀反应区别
实验方法有直接凝集实验、间接凝集实验、间接凝集抑制实验（免疫妊娠试验）、交叉凝集与凝集素吸收实验（图10-10）。
3、补体结合反应
补体作用没有特异性，可与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独与抗原或抗体结合。
如结合的抗原是红细胞，则出现溶血现象；如抗原是细菌，则溶菌；如抗原是自身成分，则发生免疫损伤。
（1）结合系统：主要是抗原（可溶性）、抗体及补体，都是液体，无可见反应，要有：
（2）指示系统（溶血系统）：羊红细胞与羊红细胞抗体（溶血素），若补体被结合，不溶血，反应阳性，说明抗原、抗体是对应的；若补体不结合，则与溶血系统结合，出现溶血，反应阴性，说明抗原、抗体不对应。
示意图：图10-23
血清学反应总结（补充讲义）
抗原抗体反应应用（现代免疫标记技术）
1、免疫荧光方法（荧光抗体法）：荧光标记抗体，荧光标记抗抗体。
2、酶免疫测定：酶标记抗体或抗抗体进行抗原抗体反应。示意图：图10-24
常用酶是辣根过氧化物酶HRP，以二氨基联苯胺DRP为底物，产生棕褐色。
双抗体夹心法和间接免疫吸附法（酶联免疫吸附试验法ELISA、酶标法）
3、放射免疫测定法RIA
4、免疫电镜技术IEM
5、发光免疫测定法LIA
各种免疫反应的敏感性比较：表10-10
5节：免疫病理
（变态反应、过敏反应）
一、概念
机体再次接受抗原或半抗原刺激后，产生的体液性或细胞性的异常免疫反应，从而引起组织损伤或生理机能障碍。
根据出现症状快慢分为速发性（与抗体有关）、迟发性（与致敏T淋巴细胞有关）变态反应。
二、各型变态反应（补充讲义）
6节：生物制品（自学）
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