生物信息学的源泉是生物分子数据，分子生物学家利用各种不同的实用工具，产生所要分析的原始数据，为生物信息学研究和应用提供依据。常用的分子生物学技术包括限制性酶消化、凝胶电泳、印迹和杂交、DNA测序、克隆、聚合酶链式反应。

限制性酶消化(restriction enzyme digest)是一种可以让研究者以特定方式操纵DNA分子并破译DNA信息内容的技术，分子生物学家将限制性内切酶(restriction enzyme) 作为精确的“剪刀”，剪切并随后“粘贴”DNA分子。用多种限制性酶切割一条DNA分子并决定产生片段的数量及其在DNA分子上的顺序，可以提供有关DNA分子特定的组织和序列信息，这种实验方法叫做限制性酶切图谱法(restriction mapping)。限制性酶也可以被用作单个基因的分离及操纵。

对于几百万个碱基对（如大肠杆菌基因组）甚至几十亿个碱基对（如人类基因组）的基因组，即使用特定的限制酶完全消化也将产生成千上万条DNA片段，需要一种技术区分这些片段。通常采用分子生物学的另一种工具——凝胶电泳(gel electrophoresis)方法将这些片段分开。凝胶电泳不仅可以分离核酸，在分离酶、蛋白质等其它生物大分子方面也具有较高的分辨率。

在成千上万个DNA片段中寻找含有某一特定基因的片段无异于大海捞针，即使这些DNA片段已按大小分开。分子生物学家通常运用另一种技术，印迹和杂交(blotting and hybridization)，来寻找他们所要研究的目的片段。在印迹中，将多核苷酸从脆弱的分离胶中转移到更为结实的支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上，并用经过标记的称为探针（probe）的单链DNA片段进行检测，利用探针与转移到膜上的核苷酸杂交情况确定检测结果。探针的长度通常为20多个核苷酸，它们是能与膜上的目的DNA片段唯一互补的序列。基于膜杂交系统的改进技术是微阵列(microarray)或DNA芯片技术。在微阵列上，成千甚至成万个核苷酸序列（作为探针）被分别固定在小的硅（玻璃）片表面，通过杂交检测目标序列。

DNA 是遗传信息的载体，了解DNA中核苷酸的排列顺序是至关重要的。20世纪70年代末期，Maxam和Gilbert发展了第一种成功的DNA测序策略，然而，Maxam-Gilbert方法(Maxam-Gilbert method)依靠化学降解来产生测序所需的小片段。几年后Sanger发展出一种更安全有效的基于DNA聚合酶的测序方法，Sanger方法又被称为链终止法(chain-termination method)。目前，DNA测序技术已经实现自动化，高性能的测序仪器与高性能的计算机相结合，极大地提高了基因组的测序能力。

对于DNA测序反应，需要有比来自于基因组DNA的限制酶消化和凝胶电泳更高纯度的和更大量的DNA。解决此类问题的简单办法是通过细胞的帮助产生足够数量和质量的特定DNA分子，即克隆(cloning)，通过克隆操作，产生大量的克隆（clone）体。本质上，克隆涉及将特定DNA片段插入类似于染色体的载体(vector)中，载体使它们能在活细胞内进行复制（并分离出）。由于所有片段的拷贝都是相同的，所以也叫分子克隆(molecular clone)，这些片段可纯化并可直接用于研究或储存在文库中以便进一步分析。所有克隆到载体上的基因的集合形成基因文库(genetic library)。一个理想的基因文库应包括一个生物体DNA中每个片段的拷贝。cDNA文库(cDNA library)是建立基因组文库的另一种选择。对基因组最感兴趣的部分往往是与蛋白编码区域相关的部分。所有蛋白编码区域共有的特征是它们被核糖体翻译之前全转化成mRNA。逆转录酶(reverse transcriptase)可将这些mRNA与细胞内的其它多核苷酸分开，并将它们转化成互补DNA（cDNA），然后克隆成为文库的一部分。由于细胞通常只转录具有重要功能的基因的mRNA，所以只展示cDNA文库往往可以抓住基因组的关键部分。另外，在任一类型的器官或细胞文库中，cDNA的相对丰度可以指示一个特定基因的表达量。cDNA序列的缺点是通常只包括核糖体翻译蛋白质的信息，而不包括重要的调控序列和内含子。

在有些情况下，可以用聚合酶链式反应（PCR, polymerase chain reaction）来代替克隆的方法。PCR方法利用DNA聚合酶对分子生物学家所感兴趣的基因组特定片段进行复制。经过一个周期扩增后，双链片段的一个拷贝被复制成两个双链拷贝。在第二轮扩增中，这两个拷贝分别被复制，共形成4个拷贝。在几个小时内，经过20到30个指数式的扩增过程，扩增的目标序列比扩增起始时其他序列的数量要多得多（理论上说，假定扩增起始时目标序列只有一个拷贝，则最后将达到2²⁰至2³⁰拷贝。虽然扩增与克隆的用途相似，但是，扩增产生DNA分子的速度及效率比克隆方法更快、更有效。PCR扩增的一个突出优点是只需使用少量的样品就可以开始扩增，而克隆则需要更多的样品量。由于扩增开始时加到反应混合物中的特定引物只结合到特定位点，所以DNA的合成只发生在基因组的特定片段。如同杂交试验中的探针，PCR引物的长度通常为20或更多个核苷酸，以保证每一条引物都能唯一与基因组的目标序列结合。最初合成引物的特定序列信息通常来自对亲缘关系较近生物体的相似区域的DNA序列分析，有时需要经过克隆和筛选这样繁琐的过程。

近几十年来，分子生物学技术不断发展。20世纪70年代初，DNA重组技术诞生，并成功地用于基因操作，从而产生了基因工程。20世纪80年代初，产生了蛋白质工程。目前，随着新的分子生物学的研究成果不断出现，这一领域的研究受到前所未有的关注，分子生物学的发展正处于高潮阶段，其中涌现出了几个极为活跃、发展迅速的领域，包括基因组学、基因表达调控研究、生物大分子的结构研究、信号跨膜转导、基因工程、蛋白质工程、基因诊断与基因治疗等。