4.RNA沉淀的清洗。
小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇l ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000 g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)。
5. RNA的溶解。
室温干燥沉淀2～5分钟（不可以离心或加热干燥，否则R N A 将会很难溶解， 有关R N A 溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明)，加入适量的RNasefree水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。

FAQs
[Q1] 一般情况下每毫克的组织或1×106个细胞中所能提取的RNA量如下表：

[Q2] 有关RNA的吸光度说明如下：
260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD₂₆₀/OD₂₈₀（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.0之间，当R<1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TEBuffer。
[Q3] 如何计算RNA的浓度？
RNA浓度=(OD260-OD320)×稀释倍数×0.04 μg/μl。
[Q4] 提取的RNA中含有多糖怎么办？
大多数的植物及动物肌肉组织中都含有大量多糖，其理化学性质与RNA十分接近，因此很难将其从RNA中除去，使用此类组织材料提取RNA时，建议增加RNAiso Reagent的使用量。
[Q5] RNA提取量较低怎么办？
① 向组织材料中加入RNAiso Reagent后，请充分研磨匀浆使其充分裂解。
② 相分离后请尽量完全回收上清液。
[Q6] 提取的RNA不溶怎么办？
① 75%乙醇清洗沉淀后不要干燥时间过长或加热干燥。
② 可以于60℃加热5分钟后再于冰上溶解数小时。
③ RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清液时，不要让枪头接触蛋白层。
④ 溶解液更换为0.5%的SDS溶液（DEPC处理水配制)。
[Q7] OD260/OD280值<1.65，为什么？
① RNA应使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定，低离子强度或低pH值会使OD280值升高。
② 样品裂解时加入的RNAiso Reagent量偏少，造成蛋白变性不充分，可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。
③ 含有裂解液的样品经匀浆混匀后未在室温静置，或静置的时间不足5分钟。
③ 提取的组织材料中含有大量的RNA分解酶，而RNAiso Reagent的添加量不够。
④ 相分离后，吸取上清液时不小心接触蛋白层造成污染。
⑤ RNA未充分溶解。
[Q8] 提取的RNA降解，为什么？
① 使用的组织材料不够新鲜。提取RNA的组织材料应采用新鲜的组织材料，或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。
② 提取RNA时使用的试剂及器材中混有RNA分解酶。
[Q9] 提取的RNA中含有DNA污染，为什么？
① 裂解组织或细胞使用的RNAiso Reagent量偏少。
② 使用的组织材料中含有大量的有机溶剂（如：乙醇、异丙醇等)、高浓度的Buffer、碱性溶剂等。
③ 如果提取的RNA中含有DNA时，可以使用DNase I
(RNase Free；TaKaRa Code：D2215）进行DNA消化。