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TaKaRa RNAiso Reagent
[ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2006-12-03|  字体: [ ]  

本制品是一种快速方便的总RNA提取试剂,可以从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取总RNA。样品在RNAiso Reagent中能够充分被裂解,在加入氯仿离心后,溶液会形成上清层、中间层和有机层(下层),RNA分布在上清层中,收集上清层后,经异丙醇沉淀便可以回收得到总RNA。
RNAiso Reagent具有很强的广谱性,可以适用于各种样品的总RNA提取,提取过程方便快速,整个操作在一小时内便可以完成。经本制品提取的总RNA纯度高,基本不含蛋白质及基因组DNA,提取的RNA可以直接用于Northern杂交、斑点杂交、mRNA纯化、体外翻译、RNA分解酶的保护分析、RT-PCR、构建cDNA文库等各种分子生物学实验。
【试剂盒之外所需准备试剂】
氯仿、异丙醇、7 5 % 乙醇( D E P C 处理水配制) 、RNase-free水(制备方法:使用RNase-free的玻璃瓶,向超纯水中加DEPC至终浓度0.01%(v/v),过夜搅拌后,高温高压灭菌。)

保存和运输
1. RNAiso Reagent在室温下可以保存12个月,为保证试剂质量,建议于2-8℃下避光保存。
2. 可以在常温下运输。

RNA提取实验前的准备
RNA制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此,在实验中必须采取以下措施:戴一次性干净手套;使用RNA操作专用实验台;在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】
尽量使用一次性塑料器皿,若用玻璃器皿,应在使用前按下列方法进行处理。
1. 用0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃下处理12小时。
2. 然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用,不要用于其它实验。
【试剂配制】
用于RNA实验的试剂,须使用干热灭菌(180℃,60分钟)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器),使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用,避免混用后交叉污染。

实验操作
1. RNAiso Reagent的使用量情况如下。
2. 实验样品的研磨和匀浆。
A. 贴壁培养细胞
① 倒出培养液,用1×PBS清洗一次。
② 每10 cm2生长的培养细胞中加入2 ml的RNAiso
Reagent,水平放置片刻,使裂解液均匀分布于
细胞表面并裂解细胞,然后使用移液枪吹打细胞
使其脱落(对于贴壁牢固的培养细胞可用细胞刮勺剥离细胞)。
③ 将内含细胞的裂解液转移至离心管中,用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④ 室温静置5分钟。

B. 悬浮培养细胞
① 将悬浮培养细胞连同培养液一起倒入离心管中,8,000 g 4℃离心2分钟,弃上清。
② 向每5×106个细胞中加入l ml的RNAiso Reagent。

C. 动物组织、植物材料样品
① 将超低温冻结的RNA提取样品称量后迅速转移至用液氮预冷的研钵中,用研杵研磨组织,其间不断加入液氮,直至研磨成粉末状(无明显的可见颗粒如果没有研磨彻底会影响RNA的收率和质量)。
② 对于普通的RNA提取样品,可以向研钵中加入适量的RNAiso Reagent,将研磨成粉末状的样品完全覆盖, 然后室温静置,直至样品完全融化,再用研杵继续研磨至裂解液呈透明状。对于特殊样品,如肝、脾、骨及软骨等,可以将研磨成粉末状的样品加入到含有适量的RNAiso Reagent的匀浆管中,把匀浆管置于冰浴中进行匀浆,直至匀浆液呈无颗粒透明状。
③ 将匀浆液转移至离心管中,室温静置5分钟。
④ 12,000 g 4℃离心5分钟。
⑤ 小心吸取上清液,移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)。
③ 用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。
④ 室温静置5分钟。

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