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cDNA合成
[ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2006-12-03|  字体: [ ]  

 (四) 电泳分析
  通常合成的cDNA第一链和第二链长度为350-6000碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀,方法见本章(二)第二链合成中的9-12步,一般第一链和第二链上样量相同。
  1. 标准分子量DNA参照物的同位素标记
  (1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA聚合酶进行32 P标记
    10×HindⅢ缓冲液 2.5μl
    dATP 0.2mmol/L
    dGTP 0.2mmol/L
    [α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi
    λDNA/HindⅢ标准DNA 1μg
    Klenow DNA聚合酶 1μ
    加H2O 到总体积25μl
  (2) 室温放置10分钟, 加2.5μl 200mM EDTA终止反应, 加入2×样品缓冲液,贮存于-20℃。
  2. 电泳分析
  (1) 用50mM NaCl, 1mM EDTA制备1.4%的碱性琼脂糖电泳, 并置碱性电泳缓冲液中30分钟。
  (2) 取样品液, 用TE调整体积, 使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2×样品缓冲液(20mmol/L NaOH, 20%甘油,0.025%溴粉兰)。
  (3) 加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3处,电泳缓冲液为30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。
  (4) 将胶浸入7% TCA中,室温放置30分钟(直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小时。
  (5) 用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压X光片(用增感屏时-70℃压片)。

   二、其它cDNA合成技术
  除Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技术外,Promega公司还提供有多个AMV合成试剂盒,不同试剂盒所提供的引物或引物一延接头(Primpr-Adaptor)不同,有oligo(dT)15 引物、随机引物、XbaⅠ引物-延接头、NotⅠ引物-延接头等,其余试剂一样,这些系统包括:
  20mg 引物
  20ml 5×第一链缓冲液, 配方如下:
  250mmol/L Tris·Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L
  MgCl2; 2.5mmol/L 亚精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT;
  20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。
  50ml 40mM焦碳酸钠
  625m rRNasin RNA酶抑制剂
  600m AMV反转录酶
  5mg 1.2kb对照RNA
  200ml 10×第二链缓冲液,配方如下:
  400mmol/L Tris·Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L
  MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
  2m E.Coli RNaseH
  500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ
  100m T4 DNA PolymeraseⅠ
  1.5ml 不含核酸酶的水
  以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40mgmRNA。

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