|
(四) 电泳分析 通常合成的cDNA第一链和第二链长度为350-6000碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀,方法见本章(二)第二链合成中的9-12步,一般第一链和第二链上样量相同。 1. 标准分子量DNA参照物的同位素标记 (1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA聚合酶进行32 P标记 10×HindⅢ缓冲液 2.5μl dATP 0.2mmol/L dGTP 0.2mmol/L [α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi λDNA/HindⅢ标准DNA 1μg Klenow DNA聚合酶 1μ 加H2O 到总体积25μl (2) 室温放置10分钟, 加2.5μl 200mM EDTA终止反应, 加入2×样品缓冲液,贮存于-20℃。 2. 电泳分析 (1) 用50mM NaCl, 1mM EDTA制备1.4%的碱性琼脂糖电泳, 并置碱性电泳缓冲液中30分钟。 (2) 取样品液, 用TE调整体积, 使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2×样品缓冲液(20mmol/L NaOH, 20%甘油,0.025%溴粉兰)。 (3) 加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3处,电泳缓冲液为30mmol/L NaOH, 1mmol/L EDTA。 (4) 将胶浸入7% TCA中,室温放置30分钟(直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小时。 (5) 用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压X光片(用增感屏时-70℃压片)。
二、其它cDNA合成技术 除Riboclone M-MLV(H-)cDNA合成技术外,Promega公司还提供有多个AMV合成试剂盒,不同试剂盒所提供的引物或引物一延接头(Primpr-Adaptor)不同,有oligo(dT)15 引物、随机引物、XbaⅠ引物-延接头、NotⅠ引物-延接头等,其余试剂一样,这些系统包括: 20mg 引物 20ml 5×第一链缓冲液, 配方如下: 250mmol/L Tris·Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L MgCl2; 2.5mmol/L 亚精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT; 20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。 50ml 40mM焦碳酸钠 625m rRNasin RNA酶抑制剂 600m AMV反转录酶 5mg 1.2kb对照RNA 200ml 10×第二链缓冲液,配方如下: 400mmol/L Tris·Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。 2m E.Coli RNaseH 500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ 100m T4 DNA PolymeraseⅠ 1.5ml 不含核酸酶的水 以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40mgmRNA。
共4页: 上一页 [1] [2] 3 [4] 下一页
上一篇:siRNAs结合生物芯片的实验设计 下一篇:TaKaRa RNAiso Reagent
|