1.磷酸钙共沉淀
将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。

2.电穿孔法
电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。

3.DEAE-葡聚糖和polybrene
带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。

4.机械法
转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。

5. 阳离子脂质体试剂
在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。现存对DNA转导原理的证据来源于内吞体和溶酶体。

6. 腺病毒载体
腺病毒由于其基因结构、功能清楚；易于制备、纯化、浓缩；宿主范围广；感染率高；理化性质稳定；不整合宿主基因组；遗传毒性和免疫毒性低的特点，成为最新RNA干扰实验研究中重要的基因载体系统。Ad2和Ad5是目前应用最广的两种腺病毒血清型。

为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：

1.纯化siRNA
在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。

2.避免RNA酶污染
微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性
通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。

4.避免使用抗生素
Ambion公司推荐从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下，可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验，以得到最佳转染效果。

5.选择合适的转染试剂
针对siRNA制备方法以及靶细胞类型的不同，选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。

6.通过合适的阳性对照优化转染和检测条件
对大多数细胞，看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞（同样适合实验靶siRNA），转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

7.通过标记siRNA来优化实验
荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

下面我们为大家提供一些常用脂质体试剂的适用细胞系信息以及转染FAQs：

1. promega公司

Promega转染试剂产品适合于人HeLa，Hep G2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；仓鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆虫S19等等细胞系的RNAi转染。详情请参阅http://www.promega.com.cn/files/cpxl/zhuanran/zhuanran.htm

2. Invitrogen公司

根据经验，我公司推荐您使用Invitrogen公司生产的lipofetamine2000试剂盒。适合于Hela,BHK,HEK,COS-7,PC12,NIH3T3等各种常用细胞系的RNAi转染。详情请参阅http://invitrogen.com/content.cfm?pageid=4547%20

3. 转染FAQs：

针对同种阳离子脂质体的疑难解答

Q1: 转染效率低

A1::1)没有使用优化的阳离子脂质体试剂。解决建议:选择针对您的细胞类型转染效率可能最高的阳离子脂质体试剂。参见附录A或网站（www.invitrogen.com）上“Transfection Collection”中的参考文献列表。

2)没有使用优化条件。解决建议: 优化阳离子脂质体试剂和DNA的量。参见第7章优化步骤。参见网站（www.invitrogen.com在Tech-online分子生物学部分）上的细胞特异性的转染步骤。

3)DNA-阳离子脂质体试剂复合物在存在血清条件下形成。解决建议: 在复合体形成时不要使用血清。OPTI-MEM I培养基和DMEM是用于复合体形成的较好的培养基。如果使用含有血清的培养基进行转染，保证在无血清条件形成复合物。注意：不要将OPTI-MEM I培养基用于LIPOFECTAMINE PLUS试剂或昆虫细胞。对于Sf9和Sf21细胞，Sf-900Ⅱ SFM会得到最佳结果。

4)存在抑制剂。解决建议: 不要在用于制备DNA-阳离子脂质体复合物的培养基中使用抗生素，EDTA，柠檬酸盐，磷酸盐，RPMI，硫酸软骨素，透明质酸，硫酸葡聚糖或其他硫酸蛋白多糖。

5)不恰当的细胞密度。解决建议: 细胞密度应该在转染时融合度为70%-90%。

6)转染DNA的启动子-增强子没有被宿主细胞识别。解决建议: 确保转染DNA的启动子-增强子同目的细胞类型兼容。

7)阳离子脂质体试剂冻结。 解决建议:不要使用冻结的或储存温度低于4℃的阳离子脂质体试剂。

8)转染分析的问题。解决建议: 转染分析中加入阳性对照。

9)质粒纯化的问题。解决建议: 请核对是否使用转染级的质粒纯化试剂盒。通常转染级的质粒纯化试剂盒使用DEAE树脂而非硅树脂，并且最好是用重力流动（过滤）的方法而不是离心技术，因为树脂带来的污染会导致较高的内毒素。另一种方法（可用于任何级别的纯化试剂盒），是在最后一步从树脂柱上洗脱质粒后，将溶液置于55℃的水浴上保温5分钟。最后小心地从上至下吸取2/3的溶液（不要碰到底部）使用。这是减少树脂的交叉污染的方法。

Q2:细胞死亡率高。

A2:1)DNA量太高。 解决建议:作一个剂量-反应曲线以确定最佳的DNA量。在剂量-反应转染中加入阳离子脂质体试剂，因为单独DNA也会对细胞生长有一个基础的影响。参见第7章微调／优化方法。

2)阳离子脂质体试剂量太高。解决建议: 作一个剂量-反应曲线以确定最佳的阳离子脂质体试剂的量。在剂量-反应转染中加入DNA，因为单独阳离子脂质体试剂也只对细胞生长有一个基础的影响。参见第7章微调／优化方法。

3)在转染过程中使用抗菌素。 解决建议:在转染过程中不要使用氯霉素，青霉素或链霉素，因为阳离子脂质体试剂使细胞更敏感。

4)细胞太少。 解决建议:作一个剂量-反应曲线以确定每个转染过程中最佳的细胞数量。根据您的应用所要求的效率调整细胞数量。

5)在无血清条件下细胞活性降低。 解决建议:使用OPTI-MEMⅠ培养基。降低或省去在无血清培养基中清洗的次数。在转染培养基中使用5%到10%的血清。确保在不存在血清的条件下形成复合物。

6)阳离子脂质体试剂氧化了。 解决建议:不要过分搅动或振荡阳离子脂质体试剂；这可能会形成阳离子脂质体试剂的过氧化物。

7)对于稳定转染，筛选抗生素加入的太快。解决建议: 在加入筛选性抗生素前至少预留48小时使细胞表达抗性基因。

Q3:阳离子脂质体试剂-DNA复合物沉淀。注意：在显微静下可以在细胞上观察到小的颗粒状颗粒沉淀。这是正常的。此沉淀是否存在并不表明转染效率的高低。

A3:1)存在过剩的EDTA。 解决建议:使用DNA水溶液，如果是在TE中，使用浓度<0.3mM的EDTA溶液稀释DNA。2)DNA或阳离子脂质体试剂浓度过高。解决建议: 确保阳离子脂质体试剂和DNA的浓度不要超过复合物形成的建议量（参见表5）。

Q4: 转染重复性不好。

A4:1) 转染时的融合度波动。 解决建议:在不同的转染时报持所有的转染参数恒定，如融合度，传代次数和生长时相等。
2)在培养中细胞发生变化。解决建议: 如果可能，使用来源于经选择转染效率较高亚系的细胞。如果可能，融化新鲜细胞。

针对不同阳离子脂质体的疑难解答

CELLFECTIN试剂或DMRIE-C试剂

Q:试剂溶液混浊。 A:这是正常的。确保在转染吸取液体前混合试剂（颠倒5到10次）。

LIPOFECTIN试剂

Q1:未稀释的试剂即混浊。 A1:不要使用。可能已冰冻或在低于4℃保存。
Q2:试剂稀释后混浊。 A2:这是正常的。未稀释的LIPOFECTIN试剂是澄清的。当稀释于OPTI-MEMⅠ时会变混浊。
Q3:转染效率低。A3: 在加入DNA前将LIPOFECTIN试剂在OPTI-MEMⅠ（或其他无血清培养基）中温育30分钟。

LIPOFECTAMINE试剂

Q:荧光背景。

A:在免疫细胞化学转染后会检测到荧光背景。LIPOFECTAMINE试剂本身没有荧光。

LIPOFECTAMINE PLUS

Q1:转染效率低

A1:1)试剂的加入顺序不对。 将DNA和PLUS试剂在稀释培养基中混合，然后将混合液同稀释的LIPOFECTAMINE试剂混合。
2):在复合前稀释的DNA或PLUS没有充分混合。 确保在混合前每孔都混合好。在进行预复合的稀释培养基中加入DNA和PLUS试剂的顺序不影响转染活性。3)没有使用LIPOFECTAMINE试剂。 确保在加入到细胞前将DNA-PLUS试剂复合物同稀释的LIPOFECTAMINE试剂混合并温育。

LIPOFECTAMINE 2000

Q1:转染效率低。

A1:1)对于在OPTI-MEMⅠ中制备的稀释液，确保稀释的LIPOFECTAMINE 2000在30分钟内同稀释的DNA混合。2)如果使用D-MEM做为稀释液，在5分钟内同稀释的DNA混合3)细胞密度对于转染太低。在转染时细胞融合度应为90%。

Q2:复合物溶液混浊。 A2:这是正常的。