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[ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2006-11-11|  字体: [ ]  

RNAi框包含与目的靶标基因互补的正义和反义区域以及“环”核苷酸,在细胞中被转录成shRNA分子(图8),shRNA被加工成siRNA,产生RNAi效应。一旦完成克隆,BLOCK-iT™ U6 RNAi 入门构建很容易被用来进行瞬时转染实验的最初的筛选。如果想要对不分裂细胞和难于转染的细胞系、原代细胞或者动物模型进行有力的转染,你可以很容易地将RNAi框转移到BLOCK-iT? RNAi慢病毒和腺病毒载体。


图8 创建带有RNAi框的哺乳动物表达载体

dsDNA寡核苷酸退火,在室温下与线性的pENTR™/U6载体共同孵育5分钟,混合物转化One Shot® TOP10 Competent E. coli.感受态细胞。获得的质粒可以直接用来进行瞬时转染,来自U6启动子的shRNA形成一个发夹结构,然后被加工成siRNA分子。然后被加工成siRNA分子。

在各种哺乳动物细胞中有效的转染和长期的shRNA表达

你将可以使用293FT细胞系和相关的ViraPower™ 试剂制备的高滴度的慢病毒储备液,进行有效的和可控制的导入。一旦制备好了慢病毒储备液,就可以转染细胞以观测RNAi反应(图9)。pLenti6/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒 RNAi 载体( pLenti6/BLOCK-iT™-DEST Lentiviral RNAi vector)提供能够长期观察稳定RNAi效应的能力。这个载体包含包装U6RNAi框到病毒所需的全部的元件,因而你能够转染shRNA到正在分裂、难于转染和不分裂的细胞中(图10)。此外,pLenti6/ BLOCK-iT™-DEST包含:
· attR位点提供U6 RNAi框从U6 RNAi入门载体上有效的重组
· 病毒转导组分和好几个安全特点提供了安全有效的转导
· 杀稻瘟菌素(blasticidin)选择标记提供表达shRNA稳定细胞株快速而高效的选择

这些特点为你在难于转染、原代和其它不分裂哺乳动物细胞以及在动物模型中进行瞬时或者长期稳定RNAi实验,提供了很大的灵活性。

图9 通过慢病毒转导阻断内源基因的表达
HeLa细胞转导MOI递增的pLenti6/BLOCK-iT®病毒,病毒编码靶定荧光素酶(对照)或者Lamin A/C 的shRNA。转导5天后,细胞裂解物进行western blot,使用抗Lamin或者抗β-actin抗体检测。靶定Lamin的shRNA抑制了lamin的表达,但是却不影响β-actin的表达。对照荧光素酶的shRNA对lamin的表达没有影响。

图10 使用pLenti6/ BLOCK-iT™-DEST RNAi载体
使用LR Clonase™ II酶混合物进行一小时的重组

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