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RNA的定量和完整性分析
[ 文章来源: | 文章作者: | 发布时间:2006-12-03|  字体: [ ]  

RNA 的完整性可以通过琼脂糖变性电泳分析检测,而含量则通过紫外分光光度计确定。常见的变性电泳有甲醛变性电泳,戊二醛变性电泳等。
3.1 甲醛变性电泳检测RNA完整性
一、材料、试剂和仪器
1 材料: 植物总RNA 5-10μg
2 试剂:
1)加样运载缓冲液(Loading buffer)
50% 甘油
1mmol/L EDTA (pH 8.0)
0.25%溴酚蓝
25%二甲苯氰FF
2)10×TAE Buffer
3)5×甲醛凝胶电泳缓冲液:
0.1mol/L MOPs (pH7.0)
40mmol/L乙酸钠
5mmol/L DETA(pH8.0)
4)甲醛, 甲酰胺
3 仪器: 电泳装置,紫外透射观测仪
二、实验程序
1 甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制
在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose (Sigama),再加20mL 10×TAE Buffer,144mLDEPC处理过的双蒸水,微波炉中化胶,待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛,放置一段时间以减少甲醛蒸汽。
2 RNA的甲醛变性电泳
1) 样品制备
RNA总量10μg
5×甲醛凝胶电泳缓冲液4μl
甲醛 3.5μl
甲酰胺10μl
加入无菌离心管中混合,95℃水浴变性2min(或55℃,15min),取出后放入冰中冷却。
2) 加入2μl无菌的DEPC处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三: 增大样品密度, 以确保DNA均匀进入样品孔内; 使样品呈现颜色, 便于加样操作; 能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置. 以 0.5 X TBE作电泳液时, 溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同 , 而二甲苯氰FF 的泳动速率与长 4kb 的双链线状DNA相同)
3)将胶板浸没在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中,点样前5V/cm预跑5min。点
样后3-4V/cm电泳。
4)电泳结束后(溴苯酚蓝迁移到约8cm处),紫外灯下观察, 照相。
3.2 RNA含量和纯度的测定
一、材料,试剂和仪器
1 材料: 待检测的RNA样品
2 试剂: DEPC-H2O
3 仪器: 紫外分析仪,石英比色杯

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