Components	SK2027	SK2028
5×M-MLV Reaction Buffer	100µl	250µl
dNTP Mix,10mmol/L	25µl	55µl
Oligo-p(dT)18 Primer, 0.5µg/µl	25µl	55µl
Random Primer p(dN)9, 0.2µg/µl	25µl	55µl
RNase Inhibitor (a), 40U/µl	20µl	50µl
M-MLV Reverse Transcriptase (b) (200U/µl)	4000U	10000U
RNase-free ddH2O	1ml	1ml
Protocol	1	1

 

(a)        1U RNase Inhibitor定义为能够抑制5ng RNase 50%活性的蛋白质量。避免反复冻融，使用时保持冰 浴。

(b)       1U M-MLV RT在37℃10分钟能将1nmol的脱氧核糖核酸变成为DE81可吸附形式。避免反复冻融，使用时保持冰浴。

(c)        试剂盒的各组成成分应在-20℃保存。

(d)       避免多次反复冻融RNA，使RNA保持在冰浴中处融化状态。

(e)        所有准备工作和实验步骤按《RNA操作指南》操作。

 

 

1．试剂盒依赖逆转录酶（M-MLV RT），以RNA为模板获得全长的第一链cDNA，其起始位点由所用引物所决定：

(1)随机九合引物[Random Primer p(dN)₉]在RNA模板上没有特异性结合位点，所有RNA都可以做为第一链cDNA合成的模板；

(2)     Oligo(dT)₁₈与poly(A)⁺mRNA的3’-末端互补，只有poly(A)⁺mRNA可作为cDNA合成的模板；

(3)     采用序列特异性引物以其结合位点为起始位点。

2．当第一链cDNA合成条件与PCR的条件能够兼容时，则本试剂盒的第一链cDNA合成产物可直接加入PCR反应混合物中进行反应。

3．第一链cDNA合成产物同样可经过处理后作为第二链合成的模板, 合成含各种标记的cDNA可以作为杂交实验的探针。

 

 

 1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：

(1) 模板RNA：

总RNA	1-5µg
或poly(A)+mRNA	0.1-0.5µg
或特异性RNA	0.01pg-0.5µg

(2) 引物：

Oligo(dT)18 (0.5µg/µl)	1µl
或随机九合引物（0.2µg/µl）	1µl
或序列特异性引物	20pmol

(3) 无RNA酶去离子水（RNase-free ddH₂O）：定容至13µl。

 

 

 

 

2．轻轻混匀后，在70℃水浴5分钟后，冰浴30秒。

3．将试管冰浴，再加入如下组分：

5×Reaction Buffer	4µl
RNase Inhibitor (40U/µl)	1µl
dNTP Mix(10mmol/L)	1µl

 

4．轻轻混匀后离心3~5秒。加入1µl M-MLV RT（200U/µl），终体积为20µl。

6．反应混合物37℃水浴40~60分钟(如果采用随机九合引物则预先在25℃温育10分钟，然后37℃水浴40~60分钟)。

7．在70℃加热10分钟结束反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存。

 

 

1．第一链cDNA的合成产物能够直接用于PCR扩增。

2．第一链cDNA的合成产物能够直接用于第二链合成必须调适为能够使用下列产品：

DNA聚合酶

T4 DNA连接酶

核糖核酸酶H

S1核酸酶

 

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RNA相关工作中的主要问题是防止RNase的污染。RNase无处不在，在实验操作的任何一步，任何偶然的疏忽或不妥当的操作都有可能造成RNase的污染，从而导致整个实验的失败。因此，严格控制实验条件，避免任何可能的污染，是保证实验成功的关键。